李自立，馬小峰，黃江偉

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽 421002)

動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病與低密度脂蛋白(LDL)、高血壓、糖尿病、吸煙等因素刺激導(dǎo)致自由基生成增多及炎性因子的大量釋放誘發(fā)的血管的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[1-2]。白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，研究[3-4]顯示，其可顯著減少活性氧簇的生成、減少動脈平滑肌細(xì)胞凋亡率，對抗動脈平滑肌細(xì)胞的氧化損傷，但其具體作用途徑尚未見研究報道。本研究成功復(fù)制AS小鼠模型，觀察了白藜蘆醇對AS小鼠的療效及其對IL-6/STAT3信號通路的影響，旨在探討白藜蘆醇抗AS的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級ApoE-/-小鼠及 C3H 小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，均購自廣東省實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，室溫保持在(24±0.2)℃，濕度保持在45%左右，黑白12 h交替，環(huán)境安靜，自由飲食水，每籠單籠飼養(yǎng)6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗。

1.2AS小鼠模型的制備及分組 10只10周齡雄性 C3H 小鼠設(shè)置為對照組，用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。將80只10周齡ApoE-/-小鼠給予高脂飼料飲食， 4 周成功復(fù)制AS 模型，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、白藜蘆醇高劑量組、白藜蘆醇低劑量組和辛伐他汀組，每組各20只。

1.3動物分組及給藥 白藜蘆醇高、低劑量組分別用0.2 mL 30 g/L和15 g/L的白藜蘆醇進(jìn)行灌胃，給藥體積為每日0.2 mL，同時繼續(xù)給予高脂飲食。模型組每天給予0.2 mL生理鹽水灌胃，繼續(xù)高脂飲食。均于每日9:00灌胃給藥，各組均給予相應(yīng)的處理14周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血脂 實驗進(jìn)行14周后禁食水12 h，摘取各組小鼠眼球并取約1 mL血液，離心后留取血清，全自動生化分析儀檢測各組小鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等變化情況。

1.4.2主動脈根部病理形態(tài)學(xué)變化 干預(yù)14周后，用10%水合氯醛麻醉并固定小鼠，在無菌操作下打開小鼠胸腔，分離胸主動脈，多聚甲醛固定、乙醇脫水，包埋，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色操作，觀察各組小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)變化。同時，用滅菌注射用水沖洗胸主動脈標(biāo)本，進(jìn)行油紅染色，觀察各組小鼠主動脈內(nèi)中性TG、脂質(zhì)蛋白情況。

1.4.3氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化 分離小鼠主動脈，在冰上采用PBS溶液制成10%的勻漿液，4 ℃離心，留取上清液，檢測各組小鼠主動脈組織中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)水平變化。

1.4.4ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá) 分離小鼠主動脈，在冰上采用PBS溶液制成10%的勻漿液，4 ℃離心，留取上清液，采用ELISA法檢測各組小鼠主動脈組織中TNF-α、IL-1、IL-6的水平。

1.4.5Western blot法檢測IL-6、JAK1、STAT3蛋白的表達(dá) 冰上分離各組檢測小鼠的主動脈，采用蛋白裂解緩沖液提取總蛋白，并采用Bradford 法進(jìn)行蛋白定量。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，進(jìn)行聚偏氟乙烯(PVDF)的轉(zhuǎn)膜，封閉，放入相應(yīng)的一抗和二抗，ECL曝光， X射線顯影后，運用凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行分析及定量，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1血脂水平比較 白藜蘆醇各劑量組及辛伐他汀組各時間點TC、TG、LDL-C、AI水平顯著低于模型組(P<0.05)。HDL-C隨著喂養(yǎng)時間的延長有逐漸增高的趨勢，但與模型組同期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.05，△：P<0.01，與模型組比較

A：對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：白藜蘆醇低劑量組；E：白藜蘆醇高劑量組

圖1白藜蘆醇對高脂血癥小鼠動脈內(nèi)膜組織病理學(xué)的影響

A：對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：白藜蘆醇低劑量組；E：白藜蘆醇高劑量組

圖2 各組小鼠動脈內(nèi)壁厚度

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

2.2組織病理學(xué)變化 干預(yù)14周后，對照組小鼠主動脈結(jié)構(gòu)正常。模型組主動脈內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，管腔內(nèi)可見斑塊形成并向管腔內(nèi)突出，內(nèi)膜增厚處可見大量泡沫細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶和炎性細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞明顯缺損，彈力板斷裂，厚薄不均。各給藥組小鼠的動脈內(nèi)膜病理情況明顯好轉(zhuǎn)，見圖1。

2.3油紅染色變化 模型組血管內(nèi)壁增厚，染色加深，而各給藥組動脈內(nèi)膜厚度變薄，染色較淡。模型組主動脈脂質(zhì)蓄積面積顯著多于對照組(P<0.05)。而各給藥組顯著少于模型組 (P<0.05)，見圖2。

2.4TUNEL染色法檢測主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡情況 模型組小鼠主動脈管腔內(nèi)可見大量的紅色顆粒(即凋亡細(xì)胞核)，位置、大小與斑塊一致。各給藥組主動脈管腔中僅見少量紅色顆粒。模型組凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。而各給藥組凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)，見表2。

2.5氧化應(yīng)激水平比較 各給藥組MDA、NO水平顯著低于模型組，SOD和GSH水平高于模型組(P<0.05)。而各給藥組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

表4 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠炎性因子水平的影響

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

2.6TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平比較 各給藥組TNF-α、IL-1及IL-6水平顯著低于模型組(P<0.05),且尤以白藜蘆醇高劑量組降低最明顯,結(jié)果見表4。

2.7JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá) 白藜蘆醇高、低劑量組p-JAK1及p-STAT3蛋白顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3及表5。

表5 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠STAT3信號通路的影響

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

A：對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：白藜蘆醇低劑量組；E：白藜蘆醇高劑量組

圖3各組JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá)

3 討 論

白藜蘆醇提取自中藥虎杖中的一類多酚類物質(zhì)，藥理學(xué)研究證實，其具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗炎、抗氧化及抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。ApoE-/-小鼠是基因敲除小鼠，通過高脂飼料飲食，可復(fù)制出AS小鼠模型，與人類AS的病理極為相似[6]。本研究顯示，給予高脂飼料飲食后，模型組小鼠TC、TG、LDL-C、AI水平逐漸升高，組織病理學(xué)觀察及TUNEL染色法均可見動脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成，提示AS小鼠模型復(fù)制成功。而給予白藜蘆醇治療后，小鼠的血脂水平顯著下降，動脈內(nèi)膜病理情況及主動脈脂質(zhì)蓄積面積均顯著好轉(zhuǎn)，提示白藜蘆醇可顯著降低AS小鼠的血脂水平，減輕AS病變程度，降低斑塊面積，延緩AS病變進(jìn)程。

研究[7-8]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了AS的病變過程。當(dāng)患者發(fā)生AS的早期，動脈內(nèi)膜發(fā)生局部氧化及抗氧化酶活性的改變，動脈內(nèi)膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基，攻擊動脈內(nèi)皮細(xì)胞，加重內(nèi)膜的炎性損傷，加速AS的病變進(jìn)程。MDA是細(xì)胞被自由基攻擊后的最終產(chǎn)物，其水平在一定程度上反映了氧自由基的代謝狀況及組織被自由基攻擊的氧化程度[9]。NO是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種氧自由基，正常情況下可對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，而在AS過程中，NO可發(fā)生過量表達(dá)，引起血管內(nèi)皮功能障礙，損傷動脈內(nèi)膜系統(tǒng)[10]。GSH和SOD是機體自由基的主要清除系統(tǒng)，維持著人體氧化系統(tǒng)與還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡，當(dāng)AS病變過程中，機體的自由基增多，GSH和SOD可被大量消耗。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠MDA、NO水平顯著高于對照組，總SOD活性和GSH水平顯著低于正常組。提示AS病變進(jìn)程中存在著活躍的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)了AS的進(jìn)程。而給予藥物治療后，MDA和NO水平顯著降低，總SOD活性和GSH含量顯著增高。說明白藜蘆醇可顯著改善一定程度上抑制了機體的氧化應(yīng)激水平，提高血管內(nèi)皮的抗氧化能力，延緩AS病變進(jìn)程，療效與辛伐他汀相當(dāng)。

IL-6/STAT3信號通路參與了AS的進(jìn)程[11]。研究顯示[12]，在AS病變中，內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌炎性因子，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。IL-6作為急性期炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，促進(jìn)STAT3的磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)其下游TNF-α、IL-6等多種炎癥因子的激活，介導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞的炎性損傷。同時，TNF-α還可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對IL-6的分泌，IL-1亦可促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成和分泌IL-6，上述信號分子共同參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷進(jìn)程，加速了AS的病變。本研究結(jié)果顯示，在AS過程中，機體的TNF-α、IL-1及IL-6水平上調(diào)，JAK/STAT3信號被激活，啟動相關(guān)炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)AS的發(fā)展。而給予白藜蘆醇治療后，各項指標(biāo)均顯著改善，說明白藜蘆醇可能通過抑制JAK1/STAT3通路減輕ApoE-/-小鼠動脈血管內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎性損傷。