葉玉妍，陳 曉，楊禮香

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

發(fā)掘野生植物資源和藥用植物資源的優(yōu)異功能基因是當(dāng)前植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。探究功能基因的表達(dá)模式是植物分子生物學(xué)的重要方面，基因表達(dá)模式的研究通常需要一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的持家基因作為參考[1]。Actin即肌動(dòng)蛋白，在不同物種中高度保守，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，能參與多種植物細(xì)胞的功能調(diào)控，響應(yīng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。編碼Actin的Actin基因普遍存在于真核生物中，能夠在植物體的不同組織表達(dá)，并且在同一時(shí)空保持相同的表達(dá)水平[2]。因此，在植物分子生物學(xué)研究中，常作為植物功能基因的內(nèi)參基因。Actin基因是一段高度保守的序列，是一個(gè)典型、龐大的基因家族，可通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物擴(kuò)增不同植物的Actin基因片段[1]。目前，已從多種植物中克隆出了Actin基因片段，如厚藤（Ipomoea pescaprae）[2]、草海桐（Scaevola sericea）[3]、葡萄（Vitis vinifera）[4]、桑樹(shù)（Morus alba）[5]、四翅濱藜（Atriplex canescens）[6]、堿蓬（Suaeda glauca）[7]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8]等。

土人參（Talinum paniculatum）又名水人參、土高麗參等，為馬齒莧科土人參屬一年生或多年生草本植物[9]，廣泛分布于長(zhǎng)江以南各地，如廣西、廣東、貴州等?。▍^(qū)）[10]。土人參易于栽培，富含黃酮類、多糖等活性物質(zhì)，莖葉可作為蔬菜食用，根可作為燉湯原料，營(yíng)養(yǎng)豐富，有補(bǔ)血益氣等作用[11-12]。此外，土人參的提取物還具有抗菌和抗氧化作用[13-14]，具有較高的食用和藥用價(jià)值。目前關(guān)于藥用植物藥用價(jià)值和活性成分提取方面的研究較多，但對(duì)功能基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription）技術(shù)克隆到土人參Actin基因的cDNA片段，可作為后期研究土人參功能基因的內(nèi)參基因，為藥用植物土人參功能基因表達(dá)和調(diào)控的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以土人參嫩葉為試驗(yàn)材料。土人參為華南植物園表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室培育，將土人參種子（購(gòu)自北京綠金藍(lán)種苗有限責(zé)任公司）種植于混合土壤（蛭石與營(yíng)養(yǎng)土為1∶3）中，22℃溫室培育30 d后，幼苗移至室外，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，收集葉片，錫紙包裹置于液氮速凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：大腸桿菌DH5α由華南植物園表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取采用HiPure Plant RNA Kits （ R4151）試劑盒法（Magen公司）。cDNA鏈按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書（全式金公司）進(jìn)行合成。DNA回收采用HiPure Gel Pure DNA Kits（Magen公司）。高保真Taq酶為ProbestTM DNA Polymerase（TakaRa公司）。pGEM-T載體購(gòu)于TakaRa公司，其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成 參照郭艷等[1]的方法，在NCBI上查詢多種植物Actin基因序列，根據(jù)所查核苷酸序設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物ActinP1和ActinP2，用于土人參Actin基因片段的擴(kuò)增，推測(cè)目的片段的長(zhǎng)度為598 bp。

1.2.2 總RNA提取 選取土人參嫩葉，按照Magen公司的HiPure Plant RNA Kits （ R4151）中的說(shuō)明書方法提取土人參葉片總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 1000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)所提RNA的濃度。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參考郭艷等[1]的方法，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA第一鏈。cDNA單鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 的說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性（94℃，5 min）；變性（94℃，30 s）、退火（56℃，45 s）、延伸（72℃，45 s），循環(huán)30次，72℃延伸10 min。

RT-PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得單一DNA片段，為RT-PCR擴(kuò)增所得的Actin基因片段。目的DNA片段的回收按照Magen公司的HiPure Gel Pure DNA Kits說(shuō)明書方法進(jìn)行。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定 將回收的DNA片段連接于pGEM-T載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，涂布在含有100 μg/mL AMP的LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，隨機(jī)用所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物ActinP1和ActinP2進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取符合條件的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，送至廣州英濰捷基公司測(cè)序。

1.2.5 序列的生物信息學(xué)分析 通過(guò)ORF finder網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），獲得測(cè)序所得核苷酸序列ORF閱讀框以及預(yù)測(cè)的氨基酸序列。在NCBI上通過(guò)BLAST比對(duì)，選取較常見(jiàn)且與TpActin1同源性較高的8種植物的Actin基因，下載它們的肌動(dòng)蛋白基因序列，包括大豆（Glycine max，XP_003523242.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_001319585.1）、甜菜 actin1（Beta vulgaris，AGW21693.1）、馬齒莧（Portulaca oleracea，AIW52352.1）、紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus，ASZ85168.1）、甜菜actin2 （Beta vulgaris，AGW21694.1）、刺兒菜（Cirsium setosum，AEY77415.1）、玉米（Zea mays，ONM08622.1），進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

TpActin1的氨基酸序列同源性分析采用Clustal Omega程序，在Clustal網(wǎng)站（http：//www.clustal.org/）上進(jìn)行，序列的著色在BoxShade網(wǎng)站（https：//embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html）上進(jìn)行。TpActin1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA6生物軟件中Neighbor-Joining算法。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測(cè)結(jié)果

將土人參嫩葉提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰可見(jiàn)，說(shuō)明提取的RNA無(wú)明顯降解情況；NanoDrop 1 000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)OD260nm/OD280nm的平均值約為2.17，無(wú)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，表明RNA純度較高，總RNA濃度為239 ng/μL。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以及NanoDrop 1 000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)后，確認(rèn)獲得的總RNA可用于下一步RT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

以土人參鮮嫩葉片提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行Actin基因PCR擴(kuò)增。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，在Marker 500～800 bp之間有1條清晰明顯的特異條帶，該DNA分子大小與預(yù)測(cè)的目的Actin基因片段（598 bp）相符（圖1），可能是土人參Actin基因片段，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3 陽(yáng)性克隆的鑒定與測(cè)序

將回收的DNA目的片段連接到pGEM-T載體上轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體 （含100 μg/mL Amp）培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取單菌落，用所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物ActinP1和ActinP2進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，得到的擴(kuò)增片段DNA分子量大小約為598 bp（圖2），與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明此克隆為陽(yáng)性克隆，可以提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。

圖1 土人參Actin基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組克隆的菌落PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 序列分析

將陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，獲得一段大小為598 bp的基因片段可編碼198個(gè)氨基酸（圖3）。將該序列在NCBI中進(jìn)行Blast對(duì)比，發(fā)現(xiàn)克隆所得片段的核苷酸序列與同為原產(chǎn)熱帶美洲的紅肉火龍果ACT7（MF356257.1）的同源性最高、達(dá)93%；與其他Actin基因的核苷酸序列的同源性也在85%以上?？寺∷闷尉幋a的氨基酸序列與同為馬齒莧科的馬齒莧（AIW52352.1）的同源性最高、達(dá)97%；與藜科的甜菜（AGW21693.1）同源性也達(dá)97%。表明克隆所得片段為土人參的Actin基因片段，將該基因命名為TpActin1，登錄在GenBank，序列號(hào)為MH333039。

圖3 土人參Actin（TpActin1）cDNA片段的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

將推測(cè)出的土人參Actin基因的氨基酸序列片段與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與土人參Actin基因同源性較高且常見(jiàn)的植物Actin基因編碼的氨基酸進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)TpActin1編碼的保守氨基酸序列多達(dá)194個(gè)，而非保守氨基酸序列僅有4個(gè)，表明TpActin1基因片段在氨基酸水平上同樣高度保守（圖4）。

由圖5可知，馬齒莧科的土人參TpActin1的氨基酸與藜科的甜菜 （Bvactin2）以及豆科的大豆 （Gmactin7）同源性最高，其次為藜科的甜菜 （Bvactin1）、菊科的刺兒菜 （Csactin）、仙人掌科的紅肉火龍果 （Hpactin7）、十字花科的擬南芥 （Atactin2）、馬齒莧科的馬齒莧（Poactin）、禾本科的玉米 （ZmActin1）。本試驗(yàn)克隆所得的片段在核苷酸和氨基酸水平均高度保守，確定為土人參的Actin基因片段，可應(yīng)用于下一步基因功能研究。

3 結(jié)論與討論

肌動(dòng)蛋白是真核生物中一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，其氨基酸序列具有高度的同源性和保守性。Zhu等[15]、Kozuka等[16]、Papakonstanti等[17]認(rèn)為，肌動(dòng)蛋白可參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的維持及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。Chang等[18]、Calvo等[19]認(rèn)為，編碼肌動(dòng)蛋白的Actin基因參與持家基因（House-keeping gene）基本功能的表達(dá)，因此常被作為常規(guī)基因表達(dá)的內(nèi)源參照。在高等植物中，有關(guān)Actin基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)的研究已較深入，Mcdowell等[20]在擬南芥中報(bào)道了8個(gè)功能性肌動(dòng)蛋白基因和2個(gè)肌動(dòng)蛋白假基因。而克隆Actin基因用于發(fā)掘植物優(yōu)異基因，是植物分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。不同植物Actin基因的克隆和序列分析可進(jìn)一步用于植物優(yōu)異基因的研究，為農(nóng)作物重要功能基因的表達(dá)分析提供內(nèi)參基因，或?yàn)檠芯恐参锟鼓嫘曰颍购怠⒖果}堿）的發(fā)掘和表達(dá)模式分析提供內(nèi)參基因[21-23]。

本試驗(yàn)以土人參嫩葉為材料，提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方法擴(kuò)增Actin基因片段，隨機(jī)挑取擴(kuò)增所得的Actin基因片段，克隆得到土人參Actin基因的cDNA片段，大小為598 bp，與鹽生植物堿蓬[7]、多漿旱生植物霸王[22]、旱生植物梭梭[23]克隆所得的基因片段大小相同。將其命名為TpActin1，并登陸在GenaBank，登錄號(hào)為MH333039。序列分析表明，TpActin1基因片段的核苷酸序列與同為原產(chǎn)熱帶美洲的紅肉火龍果ACT7（MF356257.1）的同源性最高，氨基酸序列與同為馬齒莧科的馬齒莧（AIW52352.1）的同源性最高，達(dá)97%；與藜科的甜菜（AGW21693.1）同源性也達(dá)97%。此外，TpActin1基因片段與其他已在GenaBank登錄的植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在85%以上，氨基酸序列一致性均在86%以上。因此，確認(rèn)TpActin1為高度保守且穩(wěn)定表達(dá)的持家基因，可作為土人參的內(nèi)參基因并用于其功能基因的研究。

圖4 TpActin1與其他植物Actin基因氨基酸序列的多重對(duì)比

圖5 TpActin1與其他植物Actin基因的氨基酸序列同源性分析