劉春柳，王炳權(quán)，李 玲，曹璐璐，孫照東

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193)

二至丸出自清·汪昂所著的《醫(yī)方集解》[1]，由女貞子、墨旱蓮1∶1配伍而成，偏于甘涼，歸肝、腎經(jīng)，主治肝腎陰虛證，治宜滋補(bǔ)肝腎，素有“清上補(bǔ)下第一方”之美譽(yù)，被廣泛應(yīng)用于肝膽、腎臟、婦科及消化等各科[2]，簡便廉驗(yàn)，鮮見不良反應(yīng)的報(bào)道?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，二至丸具有抗炎、抗惡性腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及改善血流變等諸多功效[3]。然而，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)和系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，動(dòng)物、細(xì)胞等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)雖可對某一機(jī)制進(jìn)行研究，但難以展現(xiàn)中藥復(fù)方的系統(tǒng)性。近年來，隨著對中藥藥理研究的日益深入，生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)的飛速發(fā)展，單成分、單靶點(diǎn)研究思路向整體探究、系統(tǒng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)變[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多靶點(diǎn)相互聯(lián)系角度闡釋中藥配伍規(guī)律與作用機(jī)制，與中醫(yī)藥整體觀念不謀而合，為探析“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”多層次作用機(jī)制提供了新的研究思路[5]?；诖?，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)辨識(shí)二至丸有效成分、預(yù)測潛在靶點(diǎn)及相關(guān)疾病等信息，從分子層面系統(tǒng)分析其多層次作用網(wǎng)絡(luò)。

1 資料與方法

1.1 二至丸成分、靶點(diǎn)及相關(guān)疾病的查詢與篩選

將女貞子、墨旱蓮分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，將口服生物利用度(oral bioavailability，OB)設(shè)置為≥30%，類藥性指數(shù)(drug like index，DL)設(shè)置為≥0.18，查詢并篩選該數(shù)據(jù)庫中所包含的上述2味中藥的有效活性成分及毒藥物動(dòng)力學(xué)(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)信息[6]，將所得信息錄入Excel表格。此外，在TCMSP平臺(tái)獲得篩選所得的化學(xué)成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并進(jìn)一步獲取靶點(diǎn)對應(yīng)的相關(guān)疾病，剔除無對應(yīng)靶點(diǎn)成分，刪除重復(fù)靶點(diǎn)及相關(guān)疾病信息，將獲取信息錄入Excel表格。在Uniprot(http：//www.uniprot.org/)中的Uniprot KB數(shù)據(jù)庫檢索篩選所得靶點(diǎn)的對應(yīng)基因，將檢索條件設(shè)置為Organism： Homo sapiens(Human)，利用Excel表格“中VLOOKUP”函數(shù)匹配靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的基因信息。獲得成分-靶點(diǎn)基因、靶點(diǎn)基因-疾病數(shù)據(jù)表格。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將二至丸“成分-靶點(diǎn)基因”“靶點(diǎn)基因-疾病”數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并將數(shù)據(jù)圖形化以網(wǎng)絡(luò)圖展示，中藥成分、靶點(diǎn)基因和相關(guān)疾病為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，彼此之間的相互聯(lián)系為節(jié)點(diǎn)之間的連線，并通過該軟件插件CytoNCA[7]進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)節(jié)點(diǎn)度(Degree)和中介中心度(betweenness centrality,BC)篩選出二至丸潛在的核心靶點(diǎn)與主要治療疾病。節(jié)點(diǎn)度及中介中心度排序是網(wǎng)絡(luò)分析中確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的主要方法之一，節(jié)點(diǎn)度及中介中心度越高，節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中作用越重要[8]。

1.3 基因通路與功能分析

采用Cytoscape 3.2.1的插件Clue GO對二至丸的成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分類富集分析、基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析[9]。

2 結(jié)果

2.1 二至丸有效成分、對應(yīng)靶點(diǎn)及相關(guān)疾病信息

在OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件下，獲得女貞子有效成分13種，墨旱蓮10種，其中木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)為2藥共有，故最終獲得二至丸中有效成分21種，見表1。21種有效成分中，有4種未找到對應(yīng)靶點(diǎn)，其余17種獲得潛在靶點(diǎn)225個(gè)，其中7個(gè)靶點(diǎn)蛋白為非人源基因，故獲得靶點(diǎn)基因218個(gè)，具有相關(guān)疾病的靶點(diǎn)105個(gè)，獲得靶點(diǎn)對應(yīng)疾病301種。

2.2 “成分-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

二至丸的“成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。該圖包含節(jié)點(diǎn)235個(gè)(深色節(jié)點(diǎn)為成分，淺色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn))，邊線407條，其中成分平均Degree為23.94，大于平均Degree的成分有5個(gè)，其中Degree最高者為槲皮素(quercetin)，其余依次為木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)和刺槐素(acacetin)。槲皮素、木犀草素、山奈酚和刺槐素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集及調(diào)節(jié)免疫保護(hù)神經(jīng)等多種藥理作用[10-14]；β-谷固醇是植物固醇，普遍認(rèn)為其具有良好的降血脂作用[15]。二至丸的“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中含有節(jié)點(diǎn)406個(gè)(深色節(jié)點(diǎn)為疾病，淺色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn))，邊線572條，其平均Degree為2.81，BC為1 314.15，見圖2。根據(jù)平均Degree與BC衡量靶點(diǎn)基因與疾病的重要性，得出Degree≥13，BC≥1 314.15的核心靶點(diǎn)10個(gè)，包括前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、花生四烯酸5脂氧合酶(Alox5)、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPARG)、肝臟藥物代謝酶(CYP1A2)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、周期蛋白依賴激酶(CDK2)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)、表皮生長因子受體(EGFR)、β2腎上腺素受體(ADRB2)及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)；獲得重要相關(guān)疾病12種，包括癌癥、炎癥、肺部及精神性疾病等多種疾病類型，見表2。

表1 二至丸有效成分的基本信息(OB≥30%，DL≥0.18)Tab 1 Main active ingredients of Erzhi pills (OB≥30%,DL≥0.18)

圖1 二至丸“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Components-targets network of main active ingredients of Erzhi pills

圖2 二至丸“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Targets-diseases network of main active ingredients of Erzhi pilll

表2 二至丸“靶點(diǎn)-疾病”拓?fù)鋮?shù)表(Degree≥6，BC≥2 040)Tab 2 Topological parameters of related diseases of Erzhi pills (Degree≥6,BC≥2 040)

2.3 基因功能分析

通過Clue GO插件對篩選的二至丸潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析，可見二至丸的靶點(diǎn)影響了991個(gè)生物學(xué)過程，主要富集過程有活性氧代謝過程的調(diào)控(regulation of reactive oxygen species metabolic process)、活性氧代謝過程的正調(diào)控(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、細(xì)胞趨化作用(cell chemotaxis)、一氧化氮代謝過程(nitric oxide metabolic process)、調(diào)節(jié)系統(tǒng)過程(regulation of system process)及雌二醇反應(yīng)(response to estradiol)等，見圖3。應(yīng)用Clue GO中的KEGG代謝通路富集分析，設(shè)定P<0.01，二至丸作用通路共36條，主要代謝通路富集于流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、補(bǔ)體與凝血相互作用(complement and coagulation cascades)及縫隙連接(gap junction)等，顯著富集通路包括尼古丁成癮(nicotine addiction)、膀胱癌(bladder cancer)、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedend-products，AGE)-AGE受體(the receptor of AGE，RAGE)信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)及白細(xì)胞介素17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)等，見圖4。

圖3 基因生物功能分析Fig 3 Gene biological function analysis

圖4 代謝通路分析Fig 4 Metabolic pathway analysis

3 討論

中醫(yī)藥診療歷經(jīng)千年，經(jīng)驗(yàn)豐富，優(yōu)勢明顯，但其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制不明確。中藥方劑是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用體系，是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的載體，也是一個(gè)繁復(fù)的化學(xué)系統(tǒng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合中藥藥理學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等多學(xué)科生物信息，將中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的復(fù)雜作用關(guān)系通過網(wǎng)絡(luò)學(xué)科語言呈現(xiàn)出來，突破了單靶點(diǎn)研究模式的束縛，有利于中藥配伍規(guī)律及作用機(jī)制的探究，為中醫(yī)藥的科學(xué)發(fā)展與創(chuàng)新提供了新的思路與方法[16]。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)理念與技術(shù)，本研究對二至丸的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，篩選所得有效化學(xué)成分21種，得到潛在對應(yīng)靶點(diǎn)225個(gè)，相關(guān)疾病301種，且女貞子、墨旱蓮中均含有犀草素、槲皮素，這2種有效成分作用相似，Degree高，對應(yīng)靶點(diǎn)可通過抗惡性腫瘤、抗炎和抗氧化來治療多種惡性腫瘤及炎癥。本研究結(jié)果提示,二至丸可同時(shí)作用于多個(gè)作用靶點(diǎn)，治療多種疾病，以惡性腫瘤居多，體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”的治療特點(diǎn)。在龐大信息數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上繪制“成分-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，直觀地展現(xiàn)了二至丸治療疾病的多重機(jī)制與相互關(guān)聯(lián)。對二至丸潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息富集分析的結(jié)果顯示，二至丸可影響991個(gè)GO生物學(xué)過程以及36條代謝通路；顯著富集結(jié)果顯示，二至丸治療疾病可能與對氧代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程的調(diào)節(jié)及對惡性腫瘤、炎癥通路的影響密切相關(guān)，多生物學(xué)過程與代謝通路為深入探討二至丸的作用機(jī)制、拓展臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二至丸可通過PI3K/Akt/RAPTRO/RICTROR信號(hào)通路保護(hù)肝細(xì)胞，抑制其凋亡[17]；趙雪瑩等[18]的研究結(jié)果顯示，二至丸可降低大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量，從而提高機(jī)體抗氧化能力；研究結(jié)果表明，二至丸防治腫瘤機(jī)制與其調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸和免疫編輯等作用相關(guān)[19]。本研究預(yù)測的靶點(diǎn)與疾病、基因功能分析等結(jié)果與現(xiàn)有研究報(bào)道一致，體現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，為二至丸的深入研究、拓展應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究對二至丸的作用機(jī)制作出了基本預(yù)測，但并不能全面展現(xiàn)二至丸的作用機(jī)制。通過數(shù)據(jù)庫對二至丸篩選的有效成分有限，故據(jù)此預(yù)測靶點(diǎn)具有一定的局限性。二至丸對于某些疾病的治療效果尚缺乏臨床實(shí)踐佐證，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測獲得的靶點(diǎn)及途徑亦需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。