龔紫薇，陳永華*，陳基權(quán)，張倩妮，歐丹玲，柳俊

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，長沙410004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

鉛鋅尾礦是一類Pb、Zn含量極高且對(duì)植物的生長產(chǎn)生脅迫的生境，采礦后破壞了礦區(qū)大部分的植被與耕地，并產(chǎn)生大量的礦業(yè)廢物，對(duì)土壤質(zhì)地和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。礦業(yè)廢物中重金屬含量較高，是主要污染源之一［1-2］，其導(dǎo)致的重金屬污染已引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注［3-6］。而選用重金屬耐受力強(qiáng)，生物量大，速生的植物對(duì)修復(fù)重金屬污染嚴(yán)重的鉛鋅尾礦庫起到了關(guān)鍵性的作用。

植物對(duì)重金屬的抗性通常表現(xiàn)為對(duì)重金屬的避性和耐性，耐性又包括金屬排斥和金屬富集兩個(gè)方面［7］。選擇性吸收、根部滯留、區(qū)域化作用等都是植物耐受重金屬毒害的策略［8］，亞細(xì)胞分布可為研究植物對(duì)重金屬的解毒和生物富集機(jī)制提供重要信息［9］。已有研究［10-11］表明，植物吸收重金屬后，會(huì)將其以不同的化學(xué)形態(tài)存在于體內(nèi)，從而限制重金屬在體內(nèi)的遷移，達(dá)到緩解毒性的目的，因此，重金屬在植物體內(nèi)的存在形態(tài)對(duì)揭示植物對(duì)重金屬的耐性也有重要意義。

紅麻（Hibiscus cɑnnɑbinus）由于具有生長迅速、較強(qiáng)的耐干旱、耐澇性以及巨大的生物產(chǎn)量等特性［12］，對(duì)多種重金屬也具有較強(qiáng)的耐性［13-14］，且紅麻作為非食用纖維經(jīng)濟(jì)作物，可避免重金屬通過食物鏈對(duì)人體造成傷害，又可以獲得較理想的經(jīng)濟(jì)效益，有望成為植物修復(fù)尾礦庫重金屬污染的一類有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅麻品種閩紅362和T14相對(duì)于同批篩選品種，能在改良鉛鋅尾礦渣中良好生長，對(duì)高濃度復(fù)合重金屬污染表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐性。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步分析這兩個(gè)紅麻品種對(duì)Pb、Zn的富集能力及Pb、Zn在植物體內(nèi)的亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)特征，以揭示其對(duì)Pb、Zn復(fù)合污染的耐性及其耐性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

閩紅362和T14種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供，鉛鋅礦渣來自湖南省郴州市某鉛鋅尾礦庫，其基質(zhì)本底值見表1，泥炭土購買于長沙紅星花卉市場(chǎng)（pH值約為6.45，有機(jī)質(zhì)含量約為90 g/kg）。

表1 基質(zhì)本底值Tab.1 Matrix background value

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽花盆口徑為30 cm，儲(chǔ)量為8 kg，泥炭土改良劑設(shè)置3個(gè)梯度，分別為對(duì)照組（CK）：100%鉛鋅礦渣+少量磷肥；改良一（T1）：15%泥炭土+85%鉛鋅礦渣+少量磷肥；改良二（T2）：30%泥炭土+70%鉛鋅礦渣+少量磷肥，3個(gè)平行，4月將紅麻種子先播種于非重金屬污染土壤中，待幼苗長至10～15 cm時(shí)將其移栽到已配置好的礦渣改良基質(zhì)中，10月成熟后收獲。

1.3 樣品采集

將收獲植株先用自來水沖洗，再用去離子水沖洗干凈，吸干表面水分。每個(gè)處理的植物樣品分為根、莖和葉這3個(gè)部位，分別用于測(cè)定重金屬全量、亞細(xì)胞組分和化學(xué)形態(tài)，剩余樣品保存于-4℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

（1）植物對(duì)Pb、Zn的富集與轉(zhuǎn)移能力指標(biāo)測(cè)定

植物樣品重金屬含量采用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)量，采用“硝酸-高氯酸體系濕法”消解。重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)計(jì)算公式如下：

富集系數(shù)（BCF）=植物體內(nèi)重金屬含量/根系土壤中重金屬含量

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植物地上部分重金屬含量/根部重金屬含量

（2）植物亞細(xì)胞組分的分離和化學(xué)形態(tài)分析

采用差速離心法分離不同的細(xì)胞組分［15］。

（3）植物體內(nèi)Pb、Zn的化學(xué)形態(tài)分析

采用化學(xué)試劑逐步提取法提取植物體內(nèi)的重金屬化學(xué)形態(tài)［16］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻對(duì)Pb、Zn的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)分析

由紅麻植株各部分Pb、Zn含量（表2）可知，Pb、Zn主要儲(chǔ)存于根部，但不同改良劑濃度處理，紅麻品種各部位的Pb、Zn含量存在差異。隨著改良劑濃度的增加，兩個(gè)品種紅麻體內(nèi)Pb、Zn含量均呈現(xiàn)對(duì)照組>改良一>改良二的規(guī)律，但地上部Zn含量與之相反，可能原因是Zn元素是植物生長的必需元素，參與植物體內(nèi)重要酶的合成，促進(jìn)植物體內(nèi)氮素的代謝，因此含量更高。

從植物的富集系數(shù)（表2）可以看出，兩紅麻品種對(duì)Pb、Zn的富集系數(shù)存在差異，對(duì)Zn的富集能力大于對(duì)Pb的富集能力。隨著改良劑濃度的增加，植物Pb、Zn的富集系數(shù)總體上呈現(xiàn)對(duì)照組>改良一>改良二的規(guī)律。各處理下閩紅362對(duì)Pb的富集能力均大于T14，而Zn的富集系數(shù)與之相反。

從植物的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（表2）可以看出，兩紅麻品種對(duì)Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于對(duì)Pb的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，且隨著改良劑濃度增加而增加，植物Pb的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在各處理間變化不明顯，Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)呈現(xiàn)對(duì)照組<改良一<改良二的趨勢(shì)。

表2 植物各部分Pb、Zn含量及其富集、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Tab.2 Pb and Zn contents in various parts of plants and their enrichment and transport coefficients

2.2 紅麻體內(nèi)Pb、Zn的亞細(xì)胞分布特征

由植物體內(nèi)Pb的亞細(xì)胞分布（圖1）可知，兩種紅麻植物葉片中的Pb主要分布于細(xì)胞器和細(xì)胞壁，占總量的75%～86%，添加改良劑后，細(xì)胞器中Pb所占比例下降；莖中的Pb主要分布在細(xì)胞壁中，占總量的58%～72%，加入改良劑后，細(xì)胞器中Pb所占比例有不同程度的下降；根中的Pb主要集中在細(xì)胞壁內(nèi)，占總量的71%～82%，添加改良劑后，閩紅362細(xì)胞器和細(xì)胞液中Pb所占比例下降，而T14細(xì)胞液中Pb所占比例上升。

圖1 植物各部位Pb的亞細(xì)胞分布Fig.1 Subcellular distribution of Pb in various parts of plants

由植物各部位Zn的亞細(xì)胞分布（圖2）可知，兩種紅麻植物葉片中的Zn主要分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞液中，占總比例的92%～97%，改良劑的加入降低了閩紅362細(xì)胞器內(nèi)Zn的占比，但提高了T14細(xì)胞器內(nèi)Zn的占比。

圖2 植物各部位Zn的亞細(xì)胞分布Fig.2 Subcellular distribution of Zn in various parts of plants

除閩紅362對(duì)照組，兩種紅麻植物莖中的Zn主要分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞液內(nèi)，占總比的93%～95%，加入改良劑后，其細(xì)胞壁的占比均有上升，說明改良劑的加入增強(qiáng)了細(xì)胞壁對(duì)Zn的滯留作用。但其對(duì)細(xì)胞器和細(xì)胞液的影響不同，閩紅362細(xì)胞器占比下降，細(xì)胞液占比上升，T14與之相反。閩紅362根中的Zn主要分布在細(xì)胞壁中，細(xì)胞壁和細(xì)胞液占比呈現(xiàn)對(duì)照組<改良一<改良二的規(guī)律，T14主要分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞液內(nèi)，各部分占比在加入改良劑后變化不大。

2.3 紅麻體內(nèi)Pb、Zn的化學(xué)形態(tài)特征

從植物體內(nèi)Pb化學(xué)形態(tài)分布（圖3）來看，兩紅麻品種葉片中Pb主要以去離子水提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)存在，其次是乙醇提取態(tài)；莖中的Pb主要以醋酸提取態(tài)存在，占總比例的66%～82%，活性較高的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)之和僅占不足10%，且隨改良劑加入量的增加而降低，醋酸提取態(tài)則有所升高；在對(duì)照下，兩種植物根部的Pb主要以氯化鈉提取態(tài)和去離子水提取態(tài)存在，隨著改良劑的加入，活性較高的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)所占比例有不同程度的下降，使得氯化鈉提取態(tài)成為主導(dǎo)形態(tài)，閩紅362醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)占比有所下降，而T14則相反。

圖3 植物體內(nèi)Pb化學(xué)形態(tài)分布Fig.3 Distribution of chemical speciation of Pb in plants

從植物體內(nèi)Zn化學(xué)形態(tài)分布（圖4）來看，兩紅麻品種莖、葉內(nèi)的Zn主要以氯化鈉提取態(tài)和去離子水提取態(tài)存在。改良劑加入后，在葉片中，活性較強(qiáng)的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)表現(xiàn)出對(duì)照組<改良組的規(guī)律，活性較弱的氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)則表現(xiàn)為對(duì)照組>改良組；而在莖部，乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)則表現(xiàn)出對(duì)照組>改良組，氯化鈉提取態(tài)表現(xiàn)為對(duì)照組<改良組；與地上部不同，兩紅麻品種根部Zn主要以醋酸提取態(tài)存在，占比達(dá)45%～76%，改良劑的加入增加了活性較強(qiáng)的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)的占比。

3 討論

3.1 兩紅麻品種對(duì)Pb、Zn的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)能力

從重金屬元素本身特性看，Zn是植物生長必需的營養(yǎng)元素，對(duì)植物的生長發(fā)育起著重要作用，而Pb是植物生長非必需元素，不管是否為必需元素，只要植物體內(nèi)重金屬含量超過一定的臨界值就會(huì)對(duì)植物生長產(chǎn)生脅迫，造成植物體內(nèi)代謝活動(dòng)紊亂，使植物生長發(fā)育受到抑制，甚至死亡［17］。本研究基質(zhì)中Pb、Zn含量分別高達(dá)3886.44～4421.17 mg/kg和2259.05～2375.42 mg/kg，遠(yuǎn)超過植物的正常耐受閾，供試的兩品種紅麻均成活下來，說明其具有一定的耐性，且表現(xiàn)出一定的Pb、Zn富集能力，這與張富運(yùn)［18］對(duì)紅麻的研究結(jié)果類似。

不同品種植物以及不同植物器官對(duì)重金屬的吸收、富集能力不同［19-21］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Pb、Zn主要分布在兩紅麻品種的根部，說明紅麻對(duì)重金屬的耐性機(jī)制主要是排除機(jī)制［22］，可能是因?yàn)楦苯优c土壤接觸、吸收，從而在根部產(chǎn)生高濃度的重金屬含量［23］。另外，土壤中的 Pb不易被植物吸收，其可溶性、生物可利用性、移動(dòng)性較差［24］，重金屬元素Zn雖然是植物所必需的微量元素之一，但該試驗(yàn)生長基質(zhì)中Zn含量遠(yuǎn)超過植物所需，植物吸收 Pb、Zn后將其保留在根部，限制有害或多余的Pb、Zn離子由根部向植物莖葉轉(zhuǎn)移，減少其對(duì)植物體的毒害［25］。

兩紅麻品種對(duì)Pb、Zn的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均未達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)，但其對(duì)Pb、Zn的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)能力表現(xiàn)出差異。可能是因?yàn)閆n是植物生長所必需的元素，植物對(duì)Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)能力遠(yuǎn)超過對(duì)Pb的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因而植物地上部Zn的含量及其轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)隨改良劑濃度的增加而增加。不同品種對(duì)同種重金屬元素的富集能力存在差異，本試驗(yàn)中閩紅362對(duì)Pb的富集能力強(qiáng)于T14，而T14對(duì)Zn的富集能力強(qiáng)于閩紅362，周航［26］對(duì)玉米的研究也出現(xiàn)過類似的結(jié)果。

圖4 植物體內(nèi)Zn化學(xué)形態(tài)分布Fig.4 Distribution of chemical speciation of Zn in plants

3.2 Pb、Zn在紅麻體內(nèi)的亞細(xì)胞分布

重金屬在細(xì)胞壁的沉淀以及細(xì)胞內(nèi)的區(qū)隔化分布是植物內(nèi)部解毒的兩個(gè)重要途徑［27-28］。朱光旭等［29］的研究表明，生長在鉛鋅尾礦污染農(nóng)田上的3種菊科植物體內(nèi)的Pb和Zn主要分布在液泡可溶組分和細(xì)胞壁中，而在細(xì)胞器中的分布較少，與本研究的結(jié)果類似。重金屬離子帶正電，因而很容易在帶負(fù)電的細(xì)胞壁處被大量絡(luò)合而沉積［30］。另外，植物細(xì)胞壁中含有蛋白質(zhì)和多糖以及大量親金屬離子的配位基團(tuán)，容易固定重金屬離子［31-32］。當(dāng)細(xì)胞壁結(jié)合的金屬離子達(dá)到飽和點(diǎn)時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的金屬離子被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中儲(chǔ)藏起來，液泡中的多種蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、有機(jī)堿等物質(zhì)，都能與重金屬結(jié)合，從而降低金屬離子的毒性［33］。Cobbett［34］研究認(rèn)為，重金屬在非代謝活性組織中的分布可減輕或避免其對(duì)功能性結(jié)構(gòu)單元的損傷和代謝過程的干擾。兩紅麻品種體內(nèi)的Pb都主要分布在細(xì)胞壁組分中，細(xì)胞壁對(duì)重金屬的固持作用是其耐受Pb的重要機(jī)制。而其體內(nèi)的Zn則主要存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞液，可見，細(xì)胞壁和液泡對(duì)Zn的區(qū)域化作用是紅麻的耐Zn機(jī)制之一。

隨著基質(zhì)中Pb、Zn濃度的增加，閩紅362根部細(xì)胞壁的分配比例下降，而T14有所增加，這可能是由于T14細(xì)胞壁中多糖、蛋白質(zhì)等對(duì)Pb、Zn的沉淀、絡(luò)合數(shù)量及能力要比閩紅362強(qiáng)［35］。

3.3 Pb、Zn在紅麻體內(nèi)的化學(xué)形態(tài)

重金屬在植物中的化學(xué)形態(tài)影響著金屬離子在植物體內(nèi)的遷移、活性以及對(duì)植物的毒性［36］。植株體內(nèi)吸收的重金屬有著不同的化學(xué)形態(tài)，隨著乙醇、去離子水、氯化鈉、醋酸和鹽酸等提取劑的極性增強(qiáng)，所提取出的重金屬在活性、毒性和遷移能力上不斷降低［37］。茶樹銀霜品種根部的Pb主要以氯化鈉提取態(tài)為主［38］，小麥莖葉部中Pb以氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和去離子水提取態(tài)存在［20］，皖景天在高濃度Zn脅迫下，根部的Zn主要以醋酸提取態(tài)存在［39］。與之類似，本試驗(yàn)中兩紅麻品種體內(nèi)Pb、Zn主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)存在，說明Pb、Zn在紅麻體內(nèi)主要以蛋白質(zhì)結(jié)合或吸附態(tài)及果膠酸鹽的形式存在，可能與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中果膠酸和蛋白質(zhì)等的固定作用有關(guān)；其次是以磷酸鹽和草酸鹽的形式存在，而這部分移動(dòng)性較差形態(tài)的重金屬可能與液泡中有機(jī)酸的絡(luò)合作用有關(guān)。

隨著改良劑濃度的增加，植物根部Zn的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)的占比上升，而乙醇和去離子水提取態(tài)的遷移能力最強(qiáng)，這也解釋了為何植物地上部Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)隨改良劑添加量的增加而增加。

4 結(jié)論

（1）紅麻能在高濃度Pb、Zn復(fù)合污染的礦渣基質(zhì)中存活，但Pb、Zn在不同品種及不同部位的分布存在差異，植物對(duì)Zn的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)能力高于對(duì)Pb的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)能力，且隨著改良劑濃度的增加，Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)呈增大的趨勢(shì)。因此，泥炭土對(duì)鉛鋅礦渣的改良是成功的，但在實(shí)地修復(fù)中，建議至少應(yīng)對(duì)修復(fù)植物根際礦渣進(jìn)行改良處理，還可嘗試對(duì)鉛鋅礦渣與泥炭土的比例作小范圍的調(diào)整。

（2）從紅麻植物不同部位Pb的亞細(xì)胞分布來看，Pb主要存在于細(xì)胞壁組分中，改良劑的加入降低了Pb在細(xì)胞器的占比；從不同部位Zn的亞細(xì)胞分布來看，Zn主要分布于植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞液，改良劑的加入使閩紅362莖部Zn在細(xì)胞液的占比上升，而在T14中則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

（3）Pb和Zn在植物體內(nèi)主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)存在，改良劑的加入，使在植物體內(nèi)活性較強(qiáng)的Pb化學(xué)形態(tài)占比下降，而根部Zn活性較強(qiáng)的化學(xué)形態(tài)占比上升。