潘根，趙立寧，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟，常麗，鄧勇，李德芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205）

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它包含一段高度保守的、約60個氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其保守的WRKYGQK氨基酸序列位于N端，而C端通常有鋅指結(jié)構(gòu)（Zincfinger motif）。其功能的行使主要是通過與目標基因啟動子區(qū)域的W-box結(jié)合來調(diào)節(jié)下游基因的表達［1］。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)的數(shù)目以及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被劃分成3類（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子包含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2；Ⅱ、Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)域的類型不同，Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，Ⅲ類為 C2HC［1］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子被大量報道參與植物的生長發(fā)育進程、生物脅迫及非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控［2-5］。在水稻中過表達OsWRKY53后，株高變高，對水稻褐飛虱的抗性提高，但同時增加了水稻對二化螟的感蟲性［6-8］。在短日照條件下，擬南芥中AtWRKY12和AtWRKY13參與調(diào)控擬南芥開花的途徑［9］。在煙草中異位表達棉花轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY17能夠提高煙草對鹽和干旱脅迫的耐性［10］。作為植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在大量物種如水稻、擬南芥等作物中被鑒定出來［10-13］。通過分析本實驗室鎘脅迫下紅麻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了一個紅麻轉(zhuǎn)錄因子Hc-WRKY20序列，本研究進一步對該基因進行克隆并進行生物信息學分析及不同外界脅迫下的表達特性研究，旨在為進一步解析該基因生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

中紅麻16號為本課題組提供。挑選籽粒飽滿的種子，待種子發(fā)芽后，移入1/2Hoag-land營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔3 d更換營養(yǎng)液。

待紅麻長至4葉1心時進行如下處理：外源激素處理：分別對紅麻葉片進行外源10 mmol/L水楊酸（SA）和1 mol/L油菜素內(nèi)酯（BR）噴施，不含上述激素的水溶液為空白對照，待噴施6 h后，分別對其葉片取樣用于RNA提取，每個處理重復3次，每個重復3棵幼苗，SA和BR分別溶于純酒精中，然后稀釋成相應(yīng)濃度的工作液；鹽脅迫處理：4葉1心的紅麻幼苗種植于50 mmol/L NaCl的1/2Hoag-land營養(yǎng)液中，處理2 d后，取紅麻根部用于RNA提??；鎘脅迫處理：4葉1心的紅麻幼苗種植于25 mmol/L CdCl2的1/2Hoag-land營養(yǎng)液中，處理2 d后，取紅麻根部用于RNA提取。

1.2 引物設(shè)計

參考紅麻轉(zhuǎn)錄組序列信息，利用Primer5.0進行引物設(shè)計，序列由擎科生物技術(shù)公司合成?；蚩寺〉囊镄蛄校篜rimer-F（5’-3’）：ATGCTGTGCCAAGTAACTTG；Primer-R（5’-3’）：TTATGGACCTGTTAGTACTCT。

1.3 RNA提取

參照植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根生化有限公司）的說明書提取總RNA，其完整性和純度用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 HcWRKY20的克隆

提取紅麻幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系：10×LAPCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，LA Taq（TaKaRa）0.25μL，dNTP（2.5 mmol/mL）1μL，F(xiàn)-primer（10 mol/mL）0.25μL，R-Primer（10 mol/mL）0.25μL，cDNA 1μL，dH2O補足至25μL。反應(yīng)程序：94℃2 min；98℃30 s，55℃30 s，68℃60 s，30個循環(huán)；68℃10 min，反應(yīng)終止于10℃，反應(yīng)結(jié)束后，取20μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，對目標片段進行割膠回收，其PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，送擎科生物技術(shù)公司進行測序。

1.5 HcWRKY20的生物信息學分析

對紅麻鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）中Unigene的注釋進行“WRKY”關(guān)鍵詞搜索，利用BioEdit獲得HcWRKY20轉(zhuǎn)錄組序列信息。進一步通過BioXM 2.0（黃驥，南京農(nóng)業(yè)大學）尋找該基因的最大開放閱讀框，并利用該軟件預測其氨基酸序列。在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中對HcWRKY20進行氨基酸序列比對（BlastP），利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹，分析該基因的進化關(guān)系。利用PSORT Prediction（https：//psort.hgc.jp/）預測其蛋白亞細胞定位情況，同時用ExPASy（www.expasy.ch/tools/pi_tool.html1）分析其蛋白質(zhì)的分子量及等電點。

1.6 HcWRKY20在不同脅迫及外源激素處理下表達量分析

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）研究HcWRKY20在不同處理下的表達特征。通過Primer 5.0設(shè)計目的基因引物，F(xiàn)（5’-3’）：CTGCTGCGTGTTCTAATGCT；Primer-R（5’-3’）：GGCGTCTCATGATCCGAAAG；內(nèi)參引物為 actin，引物序列為：F（5’-3’）：ATCCTCCGTCTTGACCTTG；Primer-R（5’-3’）：TGTCCGTCAGGCAACTCAT。qRT-PCR反應(yīng)體系為（20μL）：2×SYBR qPCR Mix 10μL，正向和反向引物各1μL，cDNA為2μL，ddH2O為6μL，反應(yīng)程序為：94℃2 min，94℃10 s，60℃34 s，40個循環(huán)，根據(jù)CT值，采用2-△△CT分別計算出目標基因的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA的提取與質(zhì)量檢測

利用天根植物總RNA試劑盒提取紅麻幼苗總RNA，然后用1%瓊脂糖檢測RNA質(zhì)量。如圖1所示，核糖體28S、18SRNA條帶清晰，且28S條帶亮度約為18S的兩倍，表明RNA結(jié)構(gòu)完整，無污染和降解，可用于后續(xù)試驗。

2.2 HcWRKY20的克隆

以紅麻鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組獲得HcWRKY20的序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5.0設(shè)計的特異性引物，以紅麻cDNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖進行檢測，其結(jié)果如圖2所示。對目標片段進行割膠回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)培養(yǎng)后，挑選陽性單克隆送湖南擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。獲得的序列在NCBI網(wǎng)站通過Blast比對發(fā)現(xiàn)與其他物種中WRKY20基因高度同源，所以該基因命名為HcWRKY20。

圖1 1%瓊脂糖檢測RNA質(zhì)量Fig.1 Detection of RNA quality by 1%agarose gel electrophoresis

圖2 HcWRKY20 CDS全長片段Fig.2 The CDSfull length fragment of HcWRKY20

2.3 HcWRKY20的生物信息學分析

利用BioXM 2.7對測序所獲得的cDNA序列進行開放閱讀框（ORF）預測，由圖3可知，其全長為1512 bp，推測其編碼503個氨基酸，等電點為7.33，分子量為55.77 KD。蛋白保守結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，HcWRKY20分別在162-168位和282-294位氨基酸包含一段高度保守的WRKYGQK七肽序列，同時含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)（見圖3）。上述結(jié)果表明，HcWRKY20屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。蛋白亞細胞定位預測表明，HcWRKY20在326-332含有一段核定位信號基序（DDPFSKRRKMDGW），主要定位在細胞核內(nèi)，可能在細胞核中行使轉(zhuǎn)錄激活/抑制功能。

圖3 HcWRKY20全長ORF序列及氨基酸序列Fig.3 Full-length ORF sequence and amino acid sequence of HcWRKY20

將該基因編碼的氨基酸在NCBI網(wǎng)站進行BlastP比對發(fā)現(xiàn)，該基因氨基酸序列與雷蒙德氏棉、陸地棉、二倍體棉、可可、榴蓮以及哥倫比亞錦葵中WRKY20序列具有較高的相似性，其同源性高達70%以上。進一步利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建了HcWRKY20系統(tǒng)進化樹（見圖4），結(jié)果表明紅麻HcWRKY20與雷蒙德氏棉、陸地棉、二倍體棉親緣關(guān)系較近，與可可、哥倫比亞錦葵親緣關(guān)系較遠。

圖4 紅麻HcWRKY20基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of HcWRKY20 gene in kenaf

2.4 HcWRKY20表達特征分析

2.4.1 HcWRKY20在不同的組織表達特異性分析

為了更好的了解HcWRKY20的生理功能，對HcWRKY20在苗期的不同組織（根、莖、葉）中進行了表達水平的分析。如圖5A所示，HcWRKY20在不同組織中表達量存在差異，在根和葉中表達量較高，而在莖中表達量較低，暗示該基因可能主要在根和葉中發(fā)揮功能。

2.4.2 NaCl等非生物脅迫下HcWRKY20基因表達分析

如圖5B所示，外源NaCl及重金屬鎘脅迫處理兩天后，HcWRKY20的表達水平均顯著高于對照處理。尤其在NaCl脅迫處理2 d時，HcWRKY20的表達量水平約為對照處理的8倍。上述結(jié)果表明，非生物脅迫（Cd和NaCl）能夠誘導HcWRKY20基因的表達。

2.4.3 外源油菜素內(nèi)酯（BR）、水楊酸（SA）處理后表達分析

前人研究［5，14］表明，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子受到BR和SA誘導表達。如圖5C所示，外源SA處理6 h后，HcWRKY20受到顯著的誘導表達，而外源BR噴施6 h后，HcWRKY20的表達水平受到顯著的抑制。

圖5 HcWRKY20基因不同組織及外源處理下表達水平分析Fig.5 Expression level analysis of HcWRKY20 in different tissues under different exogenous treatment in kenaf

3 討論

紅麻（Hibcus cɑnnɑbinus L.）是錦葵科木槿屬一年生速生纖維作物，適應(yīng)性廣，被廣泛地用于造紙、墻布、麻地膜、飼料等方面。關(guān)于紅麻基因的分離、鑒定和克隆報道較少。通過RACE技術(shù)從紅麻質(zhì)核互作雄性不育系中克隆了紅麻atp1基因［14］?；诒緦嶒炇益k脅迫下紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，本研究從高產(chǎn)多抗紅麻品種“中紅麻16號”中克隆HcWRKY20基因。該基因全長為1512 bp，推測其編碼503個氨基酸，包含兩個保守的WRKYGQK七肽序列，屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。HcWRKY20為紅麻第一個被克隆的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其在紅麻生長、發(fā)育及外界脅迫中的作用需進一步研究。

為了探究HcWRKY20潛在的生物學功能，本研究分析該基因在外源激素和不同生物脅迫下表達情況。外源SA處理能夠誘導HcWRKY20的表達，而BR抑制該基因的表達，暗示SA與BR以拮抗方式調(diào)控HcWRKY20表達，該研究結(jié)果與前人［15］在水稻中的研究結(jié)果類似。本研究同時也發(fā)現(xiàn)外源Cd和NaCl處理能夠顯著誘導HcWRKY20的表達。前人研究［16］表明，大豆GmWRKY20基因受到鹽、冷害及干旱誘導，且在擬南芥中異位表達該基因能夠顯著提高擬南芥對干旱的耐性；在苜蓿中過表達野生大豆GsWRKY20能夠顯著提高苜蓿對干旱和鹽脅迫的耐受性［17］，HcWRKY20是否參與調(diào)控植物干旱脅迫還待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)HcWRKY20受外源逆境相關(guān)激素SA和脅迫（Cd、NaCl）誘導表達，暗示該基因可能參與調(diào)控植物逆境脅迫反應(yīng)。后期研究中需通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒烌炞CHcWRKY20在紅麻逆境脅迫中的生物學功能。