戴志剛，王鳳敏，楊澤茂，盧瑞克，粟建光*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205；2.河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所，石家莊050035）

紅麻（Hibiscus cɑnnɑbinus L.）屬錦葵科木槿屬一年生草本植物，重要的韌皮纖維作物。據(jù)報道，紅麻自然雜交率在1.8%～23.7%之間［1］，屬于常異花授粉作物，在其繁殖更新過程中比自花授粉作物更易受到繁殖群體大小、繁殖種質(zhì)生活力、繁殖世代數(shù)和授粉方式等因素的影響，從而失去原有種質(zhì)的遺傳完整性［2-3］。紅麻種子中富含蛋白質(zhì)（26.1%～29.9%）和脂肪（21.3%～24.2%）［4］，與其它作物種子相比更易發(fā)生劣變［5］。因此，紅麻在貯存和更新過程中易受低發(fā)芽率、高異交率、繁殖群體量、授粉方式、收獲方式、繁殖世代數(shù)和選擇壓力等因素的影響而使其遺傳完整性發(fā)生改變。隨著貯存時間的延長，確保庫存種質(zhì)的安全保存是種質(zhì)庫管理者面臨的最大難題，而安全保存的最核心課題是確保種質(zhì)及時更新并維持其遺傳完整性［6］。目前在大豆［5，7］、蠶豆［2］、玉米［8-9］、高粱［10］、煙草［11］、棉花［12-13］、牧草［14］、小麥［15］、黑麥［15］、花椰菜［16］等作物中關于繁殖群體量和種子老化對種質(zhì)遺傳完整性影響方面的研究報道較多，而關于紅麻種子老化機理僅有不同濕度貯藏的研究報道［17］。關于紅麻種質(zhì)資源繁殖更新理論及其技術標準，國內(nèi)外尚沒有明確規(guī)定，對于紅麻種子貯存過程中一些生理生化指標、遺傳完整性影響因子等方面的研究甚少。因此，開展更新過程中繁殖群體量及種子老化對紅麻種質(zhì)遺傳完整性的影響研究，具有非常重要的理論和實踐意義。

本研究首先利用形態(tài)標記的方法，對不同繁殖群體量更新子代樣本與原樣本的葉形和莖色兩個特異標記性狀進行表型遺傳完整性分析，初步擬定適宜的繁殖群體量，其次通過人工加速老化的方法模擬種子自然劣變老化，分析老化處理后種子生活力的變化和RAPD分子標記檢測不同老化處理材料的等位基因頻率，探究貯藏過程中紅麻種子生活力變化規(guī)律及其遺傳完整性的變化，旨在為紅麻種質(zhì)的安全保存、科學更新和品種提純提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2009年11月至2010年4月在海南三亞完成不同繁殖群體樣本的繁種試驗，參試種質(zhì)26份，均由國家麻類種質(zhì)資源中期庫（國家麻類種質(zhì)資源平臺）提供，基本信息見表1。每份種質(zhì)設立50、100、150、200株4個繁殖群體量，獲得不同繁殖群體的更新子代樣本。2010年5月至9月在中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所沅江實驗基地完成了不同繁殖群體更新子代樣本與原樣本的葉形和莖色兩個形態(tài)性狀的調(diào)查與分析。

表1 供試材料的基本信息Tab.1 Basic information of tested materials

續(xù)表1

1.2 試驗方法

試驗材料中選取15份做老化處理，利用烘干法測定紅麻種子的初始含水量。用LH-150S種子老化箱采用高溫高濕的方法進行老化處理，溫度為（44±1）℃，箱體內(nèi)相對濕度95%。老化時間分別為0、20、40、60、80、100、120、140 h，處理完畢取出種子在室溫下晾 3～4 d，使種子含水量降至初始含水量后進行各項發(fā)芽指標測定。發(fā)芽試驗參照GB/T3543-1995。種子每皿100粒，3次重復，發(fā)芽溫度為25℃。第2 d統(tǒng)計發(fā)芽勢，第8 d統(tǒng)計發(fā)芽率。

各指標計算公式如下［18］：

發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ（Gt/Dt）

活力指數(shù)（VI）=GI×Sx

其中Gt為t天后的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，Sx為發(fā)芽x天后的幼苗干重。

從老化處理材料中選取遼55、83-20和臺農(nóng)1號3份種質(zhì)，利用RAPD標記檢測不同老化處理與對照的遺傳完整性差異。RAPD擴增體系為反應總體積25μL，各反應組分的終濃度如下：Buffle緩沖液（Mg+）2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶 0.04 U/μL，引物 0.4μmol/L，模板DNA 50 ng。擴增程序如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，38℃退火45 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)，72℃終延伸7 min，4℃保存。

經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，用EB染色，最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。篩選出23條引物序列。以遼55、83-20和臺農(nóng)1號3份材料的基因組DNA為模板，利用篩選出的23條RAPD標記引物對3份種質(zhì)老化后的材料和對照進行擴增。記錄擴增的條帶數(shù)（1個條帶為1個等位基因），以同一種質(zhì)未老化的材料作對照（等位基因頻率為100%），計算不同處理材料的等位基因頻率，并用t-測驗進行差異顯著性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計分析軟件Excel、SAS對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繁殖更新的適宜群體數(shù)量

在大田繁殖更新過程中，受種子生活力、病蟲危害、環(huán)境等因素影響，難以使實際繁殖群體量和設計值一致，但差異不大（見表2）。

表2 26份紅麻種質(zhì)更新子代與原樣本農(nóng)藝性狀Tab.2 Agronomic characteristics of progeny and original sample from 26 accessions of kenaf germplasm

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

紅麻葉形分為全葉和裂葉兩種類型，小區(qū)內(nèi)兩種葉形株數(shù)的比值（葉形比）反映了群體的遺傳結(jié)構。葉形比差絕對值是指各更新子代與原樣本葉形比差值的絕對值，該值越小，表明更新子代樣本與原樣本的遺傳完整性越接近。因此，通過葉形比差絕對值可以判斷各更新子代群體與原樣本群體遺傳結(jié)構的一致程度。通過表1、2的比較，26份材料原樣本的莖色和葉形原始數(shù)據(jù)與2010年沅江田間鑒定數(shù)據(jù)一致，表明原樣本在表型上保持了原始種質(zhì)的遺傳完整性。從表2可以看出，葉形比差絕對值范圍在0.000～0.139之間。其中：福紅2號、福紅991、青皮三號和青皮1號4份材料各更新子代葉形比差絕對值均為0.000，表明遺傳完整性沒有改變；V379、KB11、湘紅2號、SF192、早熟紅麻、83-20、J-1-113、C-2、新紅 95、遼 55、SD124、SD132、泰紅 763和粵紅 1號14份材料200株和150株群體的葉形比差絕對值較100株和50株群體的小，表明200株和150株更新子代群體的遺傳結(jié)構較100株和50株更接近原樣本；而紅引135、CRI156、閩紅362和印度11號4份材料不同繁殖群體的葉形比差絕對值沒有規(guī)律，以及KB2、FRA345、Gm28和臺農(nóng)1號4份材料200株和150株群體的葉形比差絕對值較100株和50株群體的大，這可能是紅麻的高異交率特性導致群體內(nèi)含有雜株造成的。

紅麻莖色有紅色、淡紅、綠色等類型。結(jié)果表明V379、KB11、紅引135、CRI156、Gm28等21份材料各更新子代群體莖色與原樣本一致，遺傳完整性沒有改變；KB2、J-1-113和青皮三號3份材料200株和150株更新子代群體莖色與原樣本一致，而100株和50株更新子代群體莖色類型減少，發(fā)生了基因丟失，表明200株和150株更新子代群體較100株和50株更能保持原樣本的遺傳結(jié)構，即更接近原樣本群體的遺傳完整性；福紅991的200株更新子代群體較原樣本莖色類型出現(xiàn)增加現(xiàn)象，可能是外源花粉串粉所導致；閩紅362的莖色類型變化無規(guī)律，可能是異交雜株或機械混雜造成的。因此，從莖色和葉形兩個表型性狀分析得出，隨著繁殖群體量的增加，更新子代群體的遺傳結(jié)構更為接近原種質(zhì)（原樣本）。

通過以上分析可初步得出同一種質(zhì)不同處理之間（不同繁殖群體）在表型上發(fā)生了基因丟失和漂移，遺傳完整性受到了影響，且繁殖群體為200株和150株的更新子代樣本，其原樣本種質(zhì)遺傳完整性的保持優(yōu)于群體量為100株和50株的。

2.2 老化對紅麻種子生活力及其遺傳完整性的影響

利用人工加速老化法對紅麻種子生活力變化及其遺傳完整性進行研究，以探究種子劣變的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為紅麻種質(zhì)資源的安全保存與更新提供理論依據(jù)。

2.2.1 老化對紅麻種子生活力的影響

由圖1可知，15個品種在老化處理過程中，隨著老化時間的延長，種子的發(fā)芽率逐漸降低（圖1），且發(fā)芽率下降的速率在品種之間有明顯差異，即有的品種經(jīng)過7個老化水平的處理后發(fā)芽率降到0，而有的品種發(fā)芽率仍在40%以上。處理過程中，多數(shù)同一品種的發(fā)芽率在不同處理間存在顯著差異（表3），尤其是后期處理與前期處理間差異顯著。種子活力指數(shù)也隨老化時間的增加逐漸降低（圖2），活力指數(shù)的降低速率在不同處理間有差異，從而說明紅麻種子生活力的喪失不是等速率的，同一品種處理前期和后期存在顯著差異（表4）。

圖1 老化處理下15個品種發(fā)芽率的變化曲線Fig.1 The germination rate changes of 15 kenaf varieties under aging treatment

表3 老化處理下15個品種發(fā)芽率的方差分析Tab.3 The germination rate variance analysis of 15 kenaf varieties under aging treatment

圖2 老化處理下15個品種活力指數(shù)的變化曲線Fig.2 The vigor changes of 15 kenaf varieties under aging treatment

表4 老化處理下15個品種活力指數(shù)的方差分析Tab.4 The vigor variance analysis of 15 kenaf varieties under aging treatment

2.2.2 老化對紅麻種質(zhì)遺傳完整性的影響

3份紅麻材料經(jīng)RAPD標記檢測，臺農(nóng)1號、83-20經(jīng)過不同老化處理后，等位基因頻率都是100%，均未檢測到差異；遼55等位基因頻率檢測結(jié)果為100.85%。進一步對同一種質(zhì)不同老化處理的等位基因頻率進行t-測驗差異顯著性分析，結(jié)果表明這3份種質(zhì)的不同老化處理之間等位基因頻率差異不顯著（表5），表明不同老化處理對紅麻這種高異交率的常異花授粉作物的種質(zhì)遺傳完整性影響不顯著。

表5 同一紅麻種質(zhì)不同老化水平RAPD分析Tab.5 RAPD analysis of kenaf gerplasm under different aging treatments

3 討論

種質(zhì)庫中種質(zhì)資源在貯存及更新過程中維持其遺傳完整性，是種質(zhì)安全保存的熱點和難點。遺傳完整性指在貯藏種質(zhì)的過程中，保持其群體的原始遺傳結(jié)構，即基因型頻率分布及等位基因頻率分布與其原始群體一致［19］。維持種質(zhì)的遺傳完整性是指種質(zhì)在貯藏的過程中，只發(fā)生最小程度的遺傳變化，在繁殖過程中使子代和親代保持最大的遺傳相似性。遺傳完整性變化有兩方面含義：一是貯藏過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，如基因突變、染色體畸變等遺傳變化；二是子代群體結(jié)構與親代群體結(jié)構相比發(fā)生了改變［20］。本研究以來源不同的26份紅麻種質(zhì)為材料，通過形態(tài)標記和分子標記的方法，探討了種子老化和繁殖群體大小對種質(zhì)遺傳完整性的影響，并初步提出更新技術指標，為紅麻種質(zhì)繁殖更新及安全保護提供參考。繁殖更新群體大小是影響種質(zhì)遺傳完整性的重要因素［21］。目前，已在多花菜豆［22］、菜薹［23］、大豆［24］、大白菜［25］和芝麻［26］等作物中開展了適宜繁殖群體量的研究，得出適宜繁殖群體量從24到200不等。本研究通過對26份紅麻種質(zhì)不同繁殖群體量的更新子代樣本與原樣本的表型遺傳完整性分析，初步得出適宜繁殖群體量為150～200株。但這一結(jié)果僅基于表型鑒定分析，應結(jié)合分子檢測手段進一步驗證繁殖群體大小對其遺傳完整性的影響，提出論據(jù)更為充分的適宜更新群體指標。

大量研究資料［5，8，12，13，15］表明，將種子進行人工老化處理，可以模擬種子的自然老化或劣變過程。因此，通過對老化處理群體與對照群體遺傳結(jié)構比較分析，可探討種子自然老化對種質(zhì)遺傳完整性的影響。周國棟［27］對不同老化程度的3份老芒麥種質(zhì)群體進行檢測，發(fā)現(xiàn)老化處理后的種質(zhì)有的DNA片段消失或含量減少，甚至出現(xiàn)新的特異DNA片段；宿宇［28］開展的人工老化處理扁蓿豆研究表明，老化后種質(zhì)的遺傳多樣性水平有所下降，但對其遺傳完整性沒有顯著影響；潘應花［29］利用SSR分子標記對經(jīng)人工老化處理后不同發(fā)芽率的野生種Nicotiɑnɑɑlɑtɑ進行遺傳完整性分析，結(jié)果表明隨發(fā)芽率的下降，群體遺傳多樣性參數(shù)均有下降，老化處理后群體的遺傳完整性降低。本研究表明人工老化對紅麻種質(zhì)遺傳完整性的影響不顯著，但隨著貯存時間的延長，老化不斷加深，種子生活力逐漸下降，導致庫存種質(zhì)樣本的有效群體數(shù)量下降。這與宿宇［29］的研究結(jié)果一致。根據(jù)《農(nóng)作物種質(zhì)資源整理技術規(guī)程》［30］和“國家麻類作物種質(zhì)中期庫管理細則”的有關規(guī)定，結(jié)合本研究結(jié)果，建議在生產(chǎn)實際中，當紅麻庫存種質(zhì)生活力（發(fā)芽率）低于70%或庫存種子有效數(shù)量低于入庫數(shù)量一半時，就必須進行繁殖更新。

紅麻種質(zhì)屬異質(zhì)群體，影響其遺傳完整性的因素較多，如低發(fā)芽率、高異交率、繁殖群體量、授粉方式、收獲方式、繁殖世代數(shù)和選擇壓力等。紅麻植株高大，花大而艷麗，且有蜜腺，由于昆蟲等影響極易發(fā)生自然異交，高異交率是影響紅麻繁殖更新過程中遺傳完整性的最主要因素之一，本文的表型鑒定結(jié)果驗證了這一點，因此紅麻種質(zhì)資源在繁殖更新過程中必須采取套袋或空間隔離等措施，以確保最大程度保持其遺傳完整性。紅麻種質(zhì)資源在貯存及更新過程中影響其遺傳完整性的因素較多，對每個因子進行科學試驗與研究是一項長期系統(tǒng)的工作。因此，構建一套完善的、科學的紅麻種質(zhì)資源安全保存和繁殖更新理論與技術體系有待進一步研究。