雷海英，白鳳麟，馮 宇，郭亞沖，喬楠茜

（長(zhǎng)治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長(zhǎng)治 046011）

1 引言

植物原生質(zhì)體是指植物細(xì)胞用一些手段如酶解法、機(jī)械法等除去細(xì)胞壁，形成由單層細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞質(zhì)[1]。原生質(zhì)體由于沒(méi)有細(xì)胞壁，相對(duì)容易攝取外源遺傳物質(zhì)，使外源DNA在原生質(zhì)體中快速表達(dá)并可按既定方向進(jìn)行培養(yǎng)，是植物作為遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料[2]，同時(shí)原生質(zhì)體也是獲得細(xì)胞無(wú)性系和選育突變的優(yōu)良起始材料[3]，因此，原生質(zhì)體是開(kāi)展基礎(chǔ)研究的理想材料。玉米原生質(zhì)體由于制備方法相對(duì)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率較高，常用于植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。

植物瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)是一種快速的、高通量、轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單的分析系統(tǒng)，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合報(bào)告基因的使用，使得研究基因的表達(dá)體系變得更加快捷，可廣泛用于基因功能的研究[4]。原生質(zhì)體的制備和純化對(duì)植物瞬時(shí)表達(dá)體系的建立起著決定性的作用，對(duì)研究基因的功能和調(diào)控途徑的研究具有重要意義。盡管玉米原生質(zhì)體的制備研究已經(jīng)有報(bào)道，但要獲得質(zhì)量且轉(zhuǎn)化能力也高的原生質(zhì)體尚需要不斷摸索。

本實(shí)驗(yàn)以玉米自交系鄭58為材料，對(duì)玉米原生質(zhì)體的制備過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)PEG法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，建立了玉米原生質(zhì)體可高效轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用玉米（Zea mays L.）自交系材料鄭58種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心提供。在本實(shí)驗(yàn)室花盆種植，培養(yǎng)箱中28℃遮光培養(yǎng)7 d左右，待玉米長(zhǎng)至二葉期至三葉期時(shí)，取第二片嫩葉制備原生質(zhì)體。所用纖維素酶R-10、離析酶R-10購(gòu)自Yakult，Japan，其余試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)經(jīng)銷商。

2.2 玉米原生質(zhì)體的制備

酶解液的配制：纖維素酶R-10、離析酶R-10、D- 甘露醇、0.05 moL/L KCl、0.4 moL MES（pH=5.7）混勻后55℃水浴至溶液清亮，待冷卻至室溫后加入0.2 moL/L CaCl2、β-巰基乙醇、BSA混勻備用。取種植7天的玉米第二片伸展的葉片約0.3 g，去除頭尾，用11號(hào)無(wú)菌刀片蘸取適量的W5（NaCl 154 mmoL/L、CaCl2 125 mmoL/L、MES 2 mmoL/L），在無(wú)菌培養(yǎng)皿中將玉米葉片切成1 mm左右的細(xì)絲，將切好的玉米葉片迅速完全浸沒(méi)在酶解液中，28℃，55 rpm/min，振蕩，于黑暗中酶解4-6 h。停止反應(yīng)后，用W5潤(rùn)濕200目的無(wú)菌濾網(wǎng)，取培養(yǎng)好的酶解液過(guò)濾，加入等體積的W5稀釋，在光學(xué)顯微鏡下觀察原生質(zhì)體。

2.3 玉米原生質(zhì)體的純化

將過(guò)濾后的原生質(zhì)體原液不同離心力離心2 min，棄上清，緩慢加入1 mL W5，指彈混勻，離心2 min，棄上清，加入100 μL W5觀察，利用原生質(zhì)體簡(jiǎn)易計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[5]。

2.4 原生質(zhì)體提取條件的優(yōu)化

采用不同酶解濃度（纖維素酶和離析酶的濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%）組成7種組合，對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與質(zhì)量進(jìn)行分析；確定最佳的酶解組合過(guò)程中同時(shí)對(duì)不同滲透壓濃度、離心力大小進(jìn)行分析，得出提取完整好的原生質(zhì)體最佳離心力，最終得出提取玉米原生質(zhì)體最佳的體系。

2.5 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

取完整的純化后的原生質(zhì)體液中加入100 μL MMg(甘露醇 0.4 moL/L、MgCl2 15 mmoL/L、MES 2 mmoL/L)重懸，轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有目的基因的 GFP標(biāo)簽重組載體：pCAMBIA1302-mGFP-m-c、pCAMBIA1302-mGFP-C、pCAMBIA1302-mGFP（空載體），轉(zhuǎn)化質(zhì)粒濃度為 10 μg/mL?；靹蚝蠹尤?30%PEG-4000 CaCl2，23℃避光放置15 min。加入2倍體積W5終止反應(yīng)，100 g離心2 min，棄上清，加入100 μL WI（4 mmoL/L MES、0.4 moL/L 甘露醇、5 mmoL/L KCl），混勻后加入24孔板中，加入WI至終體積為250 μL，23℃暗培養(yǎng)12-14 h，在激光共聚焦顯微鏡下（LSM 880，卡爾蔡司，德國(guó)）觀察轉(zhuǎn)化效果。

3 結(jié)果與討論

所有的原生質(zhì)提取結(jié)果如圖1所示，產(chǎn)率最高一般為折線圖最高點(diǎn)，但從轉(zhuǎn)化結(jié)果看來(lái)，滲透壓為0.5 mol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效率低于0.4 mol/L時(shí)的甘露醇。具體結(jié)果如下。

3.1 不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體的影響

取不同濃度的離析酶R-10、纖維素酶R-10的組合配制酶解液，通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，得出提取原生質(zhì)體時(shí)的最佳酶濃度為纖維素酶1.0%、離析酶 0.5%（表 1）。

表1 不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體分離效果的影響Tab.1 Effects of different enzyme combinations for protoplast isolation effect

3.2 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備提純的影響

酶解時(shí)間以0.5 h為時(shí)間間隔依次取樣3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h 的原生質(zhì)體，每次取2 mL樣品，離心后用W5懸浮，用量100 μL，再在普通光學(xué)顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的完整度并用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量。結(jié)果表明，當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)短時(shí)酶解不充分，酶解液中葉片幾乎完整呈黃綠色，原生質(zhì)體沒(méi)有全部釋放出來(lái)，原生質(zhì)體產(chǎn)量不高；當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)破碎嚴(yán)重，推測(cè)是由于長(zhǎng)時(shí)間的酶解使部分已解離的完整原生質(zhì)體受到損傷進(jìn)而破碎。最適酶解時(shí)間為5 h，其原生質(zhì)體活力較高，完整度好，飽滿（圖1中A-C）。

3.3 不同滲透壓對(duì)原生質(zhì)體的影響

當(dāng)甘露醇濃度在0.3 mol/L時(shí)，提取的原生質(zhì)體的體積會(huì)吸水膨脹，可知酶解液滲透壓低于原生質(zhì)體滲透壓；當(dāng)甘露醇濃度在0.4 mol/L時(shí)，提取出的原生質(zhì)體完整度較高，破損率低，原生質(zhì)體滲透壓與酶解液滲透壓逐漸平衡，原生質(zhì)體吸水漲破現(xiàn)象減少；當(dāng)甘露醇濃度為0.5 mol/L時(shí)，提取的原生質(zhì)體產(chǎn)量提高，但原生質(zhì)體會(huì)收縮。

甘露醇濃度在0.4 mol/L時(shí)玉米原生質(zhì)體與酶解液的滲透壓相近，提取的原生質(zhì)體完整度最高，產(chǎn)量適宜，破損率低（圖1中D-F）。

3.4 不同離心條件對(duì)原生質(zhì)體的影響

通過(guò)取離心力分別為 50×g、100×g、150×g、200×g、250×g、300×g，離心時(shí)間 1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，從普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的原生質(zhì)體完整度看來(lái)，當(dāng)離心力為100×g時(shí)完整度較高，隨著離心力的增大，玉米原生質(zhì)體的完整度逐漸降低，當(dāng)離心力達(dá)到400×g時(shí)原生質(zhì)體破碎度嚴(yán)重，因而最佳離心力大小為100×g、離心1 min（如圖 1 中 G-I）。

圖1 不同條件下對(duì)玉米原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響及顯微觀察結(jié)果Fig.1 Yield of different factors protoplasts isolation from leaves of maize

3.5 原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

由圖2所示，將本實(shí)驗(yàn)室研究基因[6-7]功能用帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽（GFP）的空載體pCAMBIA1302-mGFP（A-C）有微弱的自發(fā)熒光，而含有研究的目的基因玉米中心蛋白基因（centrin）的重組載體pCAMBIA1302-mGFP-C（D-G）在細(xì)胞核位置表達(dá)較亮的綠色熒光，表明瞬時(shí)體系轉(zhuǎn)化成功，且蛋白表達(dá)定位與細(xì)胞核中。

玉米原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，首先要選擇暗培養(yǎng)一周左右的玉米的第二片葉片，此時(shí)的玉米葉片中的細(xì)胞活力高，利于原生質(zhì)體的提取。其次玉米葉片要切的足夠細(xì)，且切絲時(shí)間不能太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致葉片變干從而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量。離心：由于玉米原生質(zhì)體非常脆弱，為減少對(duì)原生質(zhì)體的破壞，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有的離心步驟所用的均是平轉(zhuǎn)子。滲透壓：隨著酶解液滲透壓的增大，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸提高。這是因?yàn)楫?dāng)酶解液滲透壓低于玉米原生質(zhì)體內(nèi)部滲透時(shí)，部分原生質(zhì)體會(huì)吸水破裂，酶解液滲透壓增大后，原生質(zhì)體滲透壓與酶解液滲透壓逐漸平衡，原生質(zhì)體吸水漲破現(xiàn)象減少，玉米原生質(zhì)體產(chǎn)量會(huì)提高[8]?？梢?jiàn)滲透壓濃度在0.4 mol/L時(shí)玉米原生質(zhì)體與酶解液的滲透壓相近。PEG濃度：PEG介導(dǎo)[9]原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)，實(shí)驗(yàn)中PEG的濃度不能太高，30%比較合適，因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，高濃度的PEG會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎。最后操作過(guò)程：所有操作過(guò)程都需柔和，以免激烈震蕩使原生質(zhì)體破損，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)論

對(duì)玉米（Zea mays L.）自交系-鄭58葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備條件的優(yōu)化后，沿著葉脈橫切葉片，最佳酶濃度組合為纖維素酶1.0%，離析酶0.5%；最佳酶解時(shí)間為5 h；最佳滲透壓甘露醇濃度為0.4 mol/L；離心力為100×g、離心1 min時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒獲得了理想的結(jié)果，為今后研究目的基因的亞細(xì)胞定位及功能分析等奠定了基礎(chǔ)。

圖2 載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體Fig.2 maize protoplasts transiently transfected with pCAMBIA1302-mGFP and pCAMBIA-1302-mGFP-C plasmids