張 燕，李葆春，胡有良，汪軍成，任盼榮 ，姚立蓉 ，馬小樂(lè) ，孟亞雄 ，楊柯，王化俊

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

土壤鹽堿化和干旱是影響作物生長(zhǎng)的兩個(gè)主要非生物脅迫，特別是在干旱和半干旱地區(qū)，這兩種非生物脅迫對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有毀滅性的影響，因此，改善作物的耐鹽、抗旱性對(duì)干旱和半干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。而大麥(HordeumvulgareL.)是一種重要的旱地農(nóng)作物，可用于制造啤酒、食品及飼料等[1]。利用基因工程技術(shù)可以對(duì)大麥品種進(jìn)行定向改良，培育出抗旱耐鹽的新品種；而對(duì)大麥轉(zhuǎn)基因的研究將為其定向改良提供重要的理論依據(jù)。Kim等[2]對(duì)導(dǎo)入亞硒酸鹽抗性基因的大麥株系進(jìn)行亞硒酸鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)其硫氧還蛋白基因表達(dá)量上升，植株生長(zhǎng)較好。Delhaize等[3]探究了高濃度鋁離子和酸性條件對(duì)導(dǎo)入耐鋁基因ALMT1的大麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響，獲得了對(duì)高濃度鋁具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，并且發(fā)現(xiàn)該植株根系對(duì)磷的吸收作用也增強(qiáng)。Morran等[4]將小麥中具有抗旱功能的2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別導(dǎo)入大麥，進(jìn)行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)特性優(yōu)于野生型株系，且發(fā)現(xiàn)基因的過(guò)量表達(dá)有利于提高其抗旱性。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)是一種廣泛存在于生物體中的調(diào)控Na+/H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，在維持機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡和抵御鹽脅迫方面發(fā)揮著重要作用。植物NHX首先在大麥中被發(fā)現(xiàn)[5]，隨后，在水稻[6]、擬南芥[7]、濱藜[8]、甜菜[9]、油菜[10]、大麥[11]、棉花[12]、玉米[13]、小麥[14]和大豆[15]等多種植物中均克隆出NHX蛋白的同源基因。HgNHX1基因?yàn)橐号菽ば蚇a+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，從具有極強(qiáng)耐鹽性的鹽生草中克隆所得[16]。對(duì)轉(zhuǎn)AtNHX1基因的擬南芥、番茄和油菜進(jìn)行試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)AtNHX1基因在植物中過(guò)量表達(dá)會(huì)明顯增強(qiáng)植物的耐鹽性。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿土壤中，轉(zhuǎn)AtNHX1基因的小麥籽粒大而重，產(chǎn)量得到提高；在200 mmol·L-1NaCl處理下，轉(zhuǎn)AtNHX1棉花的植株產(chǎn)量顯著增加，產(chǎn)生的棉纖維更多。然而，關(guān)于轉(zhuǎn)HgNHX1基因?qū)Υ篼溨仓昕鼓嫘缘挠绊懀泻苌儆醒芯繄?bào)道。本研究以轉(zhuǎn)HgNHX1基因的大麥陽(yáng)性植株為材料，測(cè)定其相關(guān)的生理指標(biāo)，以期為獲得抗旱耐鹽大麥品種的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)以甘啤4號(hào)T0代轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥株系所收獲的T1代種子為試驗(yàn)材料(轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選及其HgNHX1基因的PCR檢測(cè)參見(jiàn)胡有良[17]的方法)，以甘啤4號(hào)的野生型大麥種子作對(duì)照。這些材料均由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因大麥幼苗的鹽及干旱脅迫處理

對(duì)T1代轉(zhuǎn)HgNHX1基因和野生型大麥種子每單株種于營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)材料分別種植12盆，每盆5株，30 d時(shí)將其分為2組，并分別進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理。鹽處理如下：(1)1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(對(duì)照)和1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+150 mmol·L-1NaCl溶液連續(xù)澆灌15 d，期間定時(shí)觀察表型，拍照并記錄表型變化；(2)1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(對(duì)照)和1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+150 mmol·L-1NaCl的溶液澆灌7 d后采樣，然后澆灌正常的1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液3 d后采樣。干旱處理如下：(1)自然干旱處理15 d，期間定時(shí)觀察表型變化，拍照并記錄；(2)自然干旱-復(fù)水處理，在干旱前、干旱7 d后(復(fù)水前)和干旱7 d并復(fù)水3 d 后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣。標(biāo)記清楚后置液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因大麥株系中HgNHX1 基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理，并分別于0、1 和3 d及0、3和7 d取樣。以大麥actin基因作為內(nèi)參基因，利用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)，采用2-△△Ct法計(jì)算脅迫處理下轉(zhuǎn)基因大麥株系中HgNHX1基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 大麥中相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛和游離脯氨酸含量的測(cè)定

相對(duì)含水量(relative water content，RWC)參考張慧[18]的方法進(jìn)行測(cè)定；相對(duì)電導(dǎo)率(relative electric conductivity，REC)采用陳愛(ài)葵[19]的方法進(jìn)行測(cè)定；丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法[20]進(jìn)行測(cè)定；游離脯氨酸(L-proline，L-Pro)含量采用茚三酮顯色法[21]測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因大麥中HgNHX1基因的相對(duì)表達(dá)量分析

qRT-PCR結(jié)果(圖1)表明，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因大麥株系中HgNHX1 基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上升；隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第3天達(dá)到最大值。說(shuō)明HgNHX1基因可能參與大麥對(duì)鹽和干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。并且，在鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因大麥株系中HgNHX1 基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.2 鹽和干旱脅迫過(guò)程中大麥株系表型的變化

對(duì)生長(zhǎng)30 d的大麥株系進(jìn)行鹽脅迫處理，表型變化如圖2A 所示。脅迫處理前，野生型大麥株系WT和轉(zhuǎn)基因大麥株系T表型無(wú)明顯差異，都生長(zhǎng)良好(圖2A-a)；鹽脅迫處理7 d時(shí)，各株系基部葉片葉尖都出現(xiàn)黃化和輕微萎蔫的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因株系葉片較野生型大麥株系葉片顏色更深綠，其他無(wú)明顯差異(圖2A-b)；鹽脅迫處理15 d后差異較明顯，同時(shí)出現(xiàn)萎蔫且有較多葉片變黃、失綠，但野生型大麥的癥狀更嚴(yán)重(圖2A-c)。自然干旱脅迫前的轉(zhuǎn)基因大麥株系和野生型大麥株系均生長(zhǎng)良好(圖2B-d)；干旱脅迫處理7 d的大麥株系都出現(xiàn)少量黃葉和輕微萎蔫的現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)基因大麥株系莖稈更加粗壯，長(zhǎng)勢(shì)更好(圖2B-e)；干旱處理15 d的大麥株系生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制，但轉(zhuǎn)基因大麥株系長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型大麥株系，具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因大麥株系只有少部分靠近根部的葉片變黃枯死，而野生型大麥株系整株葉片幾乎都變黃枯死(圖2B-f)。由以上結(jié)果可初步推測(cè)轉(zhuǎn)基因大麥株系的抗旱耐鹽性較野生型株系強(qiáng)。

2.3 在鹽、干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因大麥相關(guān)生理指標(biāo)的變化

由表1可知，轉(zhuǎn)基因和野生型大麥株系的RWC在鹽、干旱脅迫處理下呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)：脅迫處理7 d后各大麥株系RWC均顯著降低，停止脅迫處理3 d后顯著提高，且轉(zhuǎn)基因大麥株系在鹽脅迫后的下降程度低于野生型大麥株系，轉(zhuǎn)基因大麥株系的RWC比野生型大麥株系高9.0%，停止脅迫處理3 d后的上升程度高于野生型大麥株系，轉(zhuǎn)基因大麥株系的RWC比野生型大麥株系高10.2%。自然干旱脅迫處理7 d后，各大麥株系RWC都顯著下降，轉(zhuǎn)基因大麥株系RWC高于野生型大麥株系，但差異不顯著；復(fù)水處理3 d后，大麥株系RWC顯著回升，轉(zhuǎn)基因大麥株系RWC顯著高于野生型大麥株系。因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因大麥株系而言，鹽和干旱脅迫所造成的水分損失少于野生型大麥株系，說(shuō)明HgNHX1基因在轉(zhuǎn)基因大麥株系中能夠正常表達(dá)并提高了轉(zhuǎn)基因大麥株系在鹽和干旱脅迫下的保水能力，從而使得轉(zhuǎn)基因大麥株系在鹽和干旱脅迫下能夠維持較高的水分代謝水平。

圖柱上的小寫字母不同表示在0.05水平上差異顯著。Different lower-case letters above bars indicate significantly different at 0.05 level.

WT：野生型大麥株系；T：轉(zhuǎn)基因大麥株系；A：鹽脅迫下大麥表型；B：干旱脅迫下大麥株系的表型。a：鹽脅迫處理前；b：鹽脅迫處理7 d時(shí)；c：鹽脅迫處理15 d時(shí)；d：干旱脅迫處理前；e：干旱脅迫處理7 d時(shí)；f：干旱脅迫處理15 d時(shí)。WT:wild-type barley lines; T:transgenic barley lines; A:phenotype of barley under salt treatment B:phenotype of barley under drought treatment; a:phenotype of barley before salt treatment; b:phenotype of barley under salt treatment for 7 days; c:phenotype of barley under salt treatment for 15 days; d:phenotype of barley before drought treatment; e:phenotype of barley under drought treatment for 7 days; f:phenotype of barley under drought treatment for 15 days.

兩種脅迫處理后，REC、MDA含量和L-Pro含量的變化趨勢(shì)總體一致，均為脅迫處理7 d顯著上升，停止脅迫處理3 d后又顯著下降，且轉(zhuǎn)基因大麥株系在鹽、干旱脅迫后的上升程度與停止脅迫處理后的下降程度均低于野生型大麥株系。

鹽脅迫處理前及停止脅迫處理3 d 后，轉(zhuǎn)基因大麥株系的REC、MDA含量和L-Pro含量均比野生型大麥株系低，但差異均未達(dá)到顯著水平。鹽脅迫處理7 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因大麥株系的REC和MDA含量顯著低于野生型大麥株系，分別為野生型大麥株系的92.40%和89.26%； L-Pro含量顯著高于野生型大麥株系，是野生型大麥株系的1.08倍。

干旱脅迫處理前，轉(zhuǎn)基因大麥株系的REC、MDA含量和L-Pro含量均比野生型大麥株系低，但差異均未達(dá)到顯著水平。干旱脅迫處理7 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因大麥株系的REC和MDA含量顯著低于野生型大麥株系，分別為野生型大麥株系的76.58%和76.46%；L-Pro含量顯著高于野生型大麥株系，是野生型大麥株系1.39倍。停止干旱脅迫并復(fù)水處理3 d后，轉(zhuǎn)基因大麥株系的REC和MDA含量仍然顯著低于野生型大麥株系，分別為野生型大麥株系的81.48%和79.72%；L-Pro含量與野生型大麥株系差異不顯著。

以上結(jié)果說(shuō)明，鹽和干旱脅迫造成轉(zhuǎn)基因大麥株系的電解質(zhì)外滲量少于野生型大麥株系，HgNHX1基因在轉(zhuǎn)基因大麥株系中的表達(dá)能夠緩解鹽、干旱脅迫對(duì)細(xì)胞膜的傷害。

表1 鹽、干旱脅迫對(duì)大麥相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量和游離脯氨酸含量的影響Table 1 Effect of salt and drought stress on relative water content, relative electric conductivity, malondialdehyde content and free proline content in barley

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，在許多植物中，NHX1的過(guò)量表達(dá)都能夠顯著增加植物的耐鹽性。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物內(nèi)的離子均衡受到一定程度的破壞，從而影響到細(xì)胞對(duì)K+的吸收，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na+會(huì)產(chǎn)生離子毒害，阻礙細(xì)胞正常生長(zhǎng)甚至?xí)?dǎo)致死亡。降低細(xì)胞中過(guò)多Na+有很多方法，如Na+區(qū)隔化。研究發(fā)現(xiàn)，Na+區(qū)隔化能有效的將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+維持最低狀態(tài)。植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是將細(xì)胞中過(guò)多Na+區(qū)隔化進(jìn)液泡中的關(guān)鍵因素，它會(huì)利用質(zhì)子泵產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力，逆著Na+濃度梯度，將細(xì)胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化進(jìn)液泡中[22]。本試驗(yàn)通過(guò)150 nmol·L-1NaCl脅迫處理轉(zhuǎn)基因HgNHX1大麥株系，利用qRT-PCR技術(shù)研究其在大麥中的表達(dá)特性及表達(dá)豐度。結(jié)果表明，正常情況下，HgNHX1表達(dá)量較低，鹽脅迫誘導(dǎo)后的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，說(shuō)明HgNHX1基因很可能參與了大麥抗鹽脅迫反應(yīng)，這與徐先良等[16]在鹽生草中的研究結(jié)果相似。為進(jìn)一步探究基因的功能，本研究分析了在鹽脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥的各個(gè)生理指標(biāo)，主要為兩個(gè)正相關(guān)指標(biāo)(如RWC和L-Pro含量)和兩個(gè)負(fù)相關(guān)指標(biāo)(如REC和MDA含量)，即在三個(gè)不同處理時(shí)間點(diǎn)(正常情況下、鹽脅迫后和恢復(fù)正常情況后)，轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥株系RWC和L-Pro含量均高于野生型大麥株系；REC和MDA含量均低于野生型大麥株系。本結(jié)果與前人在其他植物中研究報(bào)道的結(jié)果有差異[23]，可能是因?yàn)榇篼湵旧砭哂泻軓?qiáng)的耐鹽性，或是HgNHX1基因?qū)τ谔岣叽篼溨晗的望}性的效果不顯著。

在干旱脅迫環(huán)境下，植物常常通過(guò)自我保護(hù)機(jī)制即減少葉面積、降低植株高度和抑制代謝活動(dòng)等繼續(xù)存活。本試驗(yàn)通過(guò)自然干旱脅迫處理轉(zhuǎn)基因HgNHX1大麥株系，結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因大麥株系中HgNHX1 基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，且在處理3 d時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明HgNHX1基因可能參與了大麥對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。本文還分析了在干旱脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥的各種生理指標(biāo)，即在三個(gè)不同處理時(shí)間點(diǎn)(正常情況下、干旱脅迫后、復(fù)水3 d后)，轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥株系RWC和L-Pro含量均顯著高于野生型大麥株系；REC和MDA含量均低于野生型大麥株系。研究結(jié)果與前人在其它植物中研究報(bào)道的結(jié)果基本一致，可能是因?yàn)榇篼湵旧砭哂泻軓?qiáng)的抗旱性，或是HgNHX1基因?qū)τ谔岣叽篼溨晗悼购敌缘男Ч^顯著。

本研究通過(guò)鹽和干旱脅迫處理轉(zhuǎn)HgNHX1基因大麥陽(yáng)性植株和野生型大麥植株，由各生理指標(biāo)的變化得出，HgNHX1基因在轉(zhuǎn)基因大麥中能夠正常表達(dá)并提高轉(zhuǎn)基因大麥的保水能力和耐鹽抗旱性，從而使得轉(zhuǎn)基因大麥能夠維持較高的水分代謝和抗旱耐鹽機(jī)制；HgNHX1基因更能夠降低鹽、干旱脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，具有更強(qiáng)的抗氧化能力。總而言之，HgNHX1基因參與了大麥對(duì)鹽、干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。但由于實(shí)驗(yàn)試材較單一，本實(shí)驗(yàn)抗旱耐鹽生理指標(biāo)的測(cè)定值，不能簡(jiǎn)單地作為判斷其抗旱耐鹽性的依據(jù)，但為進(jìn)一步深入研究提供了可靠的數(shù)據(jù)參考，為探索大麥抗旱耐鹽分子機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為大麥抗旱耐鹽基因工程奠定了理論基礎(chǔ)。