王娜娜 江楠 楊曉慶 房磊 孫青

肺癌是目前世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占其總數(shù)的85%[2-4]，成為嚴(yán)重威脅人們生命健康的社會(huì)問題。現(xiàn)有的NSCLC病理分類依據(jù)是建立在形態(tài)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的2015版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）肺部腫瘤的組織病理學(xué)分類，由于肺組織本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，癌組織又存在不同程度的異質(zhì)性，在臨床病理診斷中往往會(huì)遇到部分含混不清且難以分辨者，直接影響治療方案的正確選擇。本研究從組織起源的角度對(duì)NSCLC進(jìn)行表型分化分類，結(jié)合其表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變檢測(cè)和預(yù)后分析，力求使目前的NSCLC組織病理學(xué)分類更加清晰明了，更貼近指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院病理科自2010年1月-2013年12月NSCLC患者石蠟包埋組織標(biāo)本共105例。依據(jù)2015年WHO肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理診斷醫(yī)師對(duì)全部切片進(jìn)行病理分類，挑選同時(shí)具有正常肺組織和癌組織的切片及對(duì)應(yīng)蠟塊，為本研究所用；所有患者術(shù)前均未接受放療及化療。其中男性76例，女性29例。＜61歲者52例，≥61歲者53例。腫瘤直徑≤3 cm者38例，＞3 cm者67例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者71例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例。本研究已通過山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)雙染色

1.2.1 儀器及試劑 Bench Mark全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（美國(guó)Roche公司）；TTF-1鼠抗人抗體（Mab-0599，邁新公司），P63鼠抗人抗體（Mab-0365，邁新公司），Napsin A兔抗人抗體（LBP-m198，安必平公司），CK7鼠抗人抗體（LBP-mo61，安必平公司）；ultraView Red二抗試劑盒（美國(guó)Roche公司）。

1.2.2 染色步驟 預(yù)先對(duì)免疫組化儀進(jìn)行編程，使用P63/NapsinA組合，TTF-1/CK7組合。組合抗體中前者使用DAB顯色，染色呈棕色；后者使用堿性品紅染液顯色，染色呈紅色。

1.2.3 結(jié)果判定 NapsinA、CK7陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，染色呈紅色；P63、TTF-1陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，染色呈棕褐色。著色即判為陽性，散在點(diǎn)灶狀陽性、彌漫陽性、彌漫強(qiáng)陽性均視為陽性表達(dá)，不著色則判為陰性。

1.3 SANGER測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變 常規(guī)提取石蠟組織內(nèi)DNA，以設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用下述各突變引物序列進(jìn)行擴(kuò)增：EGFR第18號(hào)外顯子正向引物：5'-CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC-3'，反向引物：5'-GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC-3'；EGFR第19號(hào)外顯子正向引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'，反向引物：5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；EGFR第20號(hào)外顯子正向引物：5'-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3'，反向引物：5'-CATATCCCCATGGCA A ACTCTTGC-3'；EGFR第21號(hào)外顯子正向引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，反向引物：5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 1 μL；正反向引物各0.5 μL；10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mix 2 μL；StarTaq DNA Polymerase 0.25 μL；Distilled water 15.75 μL。PCR反應(yīng)條件：置PCR擴(kuò)增儀中95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性50 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)10次，94 ℃變性50 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次，最后于72 ℃延伸10 min。使用美國(guó)Applied Biosystem公司3150型基因序列分析儀進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用Applied Biosystem公司Data Collection與Sequencing Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 腫瘤表達(dá)指標(biāo)與臨床病理參數(shù)的聯(lián)系采用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率法；單因素生存分析采用Kaplan-Meier法；所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0（SPSS, Chicago,IL, USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P63/NapsinA、TTF-1/CK7在正常肺組織的定位及其表達(dá) CK7、NapsinA陽性染色呈紅色，位于細(xì)胞漿；P63、TTF-1陽性染色呈棕黃色/棕褐色，位于細(xì)胞核。P63表達(dá)于所有支氣管呼吸上皮的基底細(xì)胞和分泌腺的肌上皮細(xì)胞，而肺泡上皮細(xì)胞不表達(dá)；CK7表達(dá)于所有支氣管呼吸上皮細(xì)胞（假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮、單層柱狀上皮）、分泌腺上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞；TTF-1主要表達(dá)于終末小支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞。NapsinA僅表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞。

2.2 P63/NapsinA、TTF-1/CK7在NSCLC中的表達(dá) P63陽性表達(dá)于鱗癌、貼壁狀腺癌、腺泡狀腺癌和實(shí)體狀腺癌（依據(jù)2015年WHO肺癌分類）中，陽性表達(dá)率分別為100%（41/41）、47.37%（6/13）、53.65%（22/41）、80%（8/10）；CK7陽性表達(dá)在貼壁狀腺癌、腺泡狀腺癌和實(shí)體狀腺癌中，陽性表達(dá)率為100%，鱗癌中未見表達(dá)；TTF-1陽性表達(dá)于貼壁狀腺癌、腺泡狀腺癌和實(shí)體狀腺癌中，陽性表達(dá)率分別為84.61%（11/13）、88.89%（36/41）、70.00%（7/10），鱗癌中未見表達(dá)；NapsinA陽性表達(dá)在貼壁狀腺癌、腺泡狀腺癌和實(shí)體狀腺癌中，陽性表達(dá)率分別為15.38%（2/13）、78.95%（32/41）和60%（6/10），鱗癌中未見表達(dá)。

表1 P63、CK7、TTF-1、NapsinA在肺癌組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of p63、CK7、TTF-1、NapsinA in lung cancer tissue

表2 正常肺組織及不同組織起源NSCLC免疫表型的關(guān)系Tab 2 The relationship between normal lung tissue and NSCLC immune phenotypes in different tissues

結(jié)合免疫表型特征、組織學(xué)形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)NSCLC與相對(duì)應(yīng)解剖部位的正常組織免疫表型具有一致性，雙染免疫組化染色圖片見圖1。單純的鱗狀細(xì)胞癌P63呈陽性表達(dá)，而CK7、TTF-1、NapsinA陰性；單純腺癌：CK7陽性，TTF-1部分陽性，部分陰性，而P63和NapsinA陰性；支氣管發(fā)生的鱗腺混合型癌：P63和CK7彌漫陽性，NapsinA陰性，而TTF-1部分病例陽性，部分病例陰性；肺泡細(xì)胞癌：CK7、TTF-1和NapsinA陽性，而P63陰性；細(xì)支氣管肺泡癌：CK7、TTF-1、NapsinA陽性，P63散在陽性，105例NSCLC免疫組化結(jié)果見表1。由此可見支氣管、肺泡單位正常組織和對(duì)應(yīng)部位的肺癌具有表型的一致性，細(xì)支氣管肺泡癌則同時(shí)具有細(xì)支氣管腺癌和肺泡細(xì)胞癌的共同特點(diǎn)，呈現(xiàn)一種過渡性表型特征，見表2。

據(jù)此，我們將NSCLC分為以下幾種組織表型，即支氣管上皮癌（起源于各級(jí)支氣管，分為單純鱗癌、單純腺癌和腺鱗癌）、細(xì)支氣管肺泡癌（起源于終末細(xì)支氣管肺泡單位）、肺泡細(xì)胞癌（起源于肺泡上皮）、分泌腺癌（起源于支氣管粘膜下小唾腺）。本研究中僅有2例小涎腺來源的腺癌，其免疫表型為CK7陽性，P63陽性1例，陰性1例，雖然在免疫表型上與支氣管腺鱗癌相同，但由于具有特殊的組織形態(tài)，兩者鑒別并不困難。

依據(jù)依據(jù)2015年W HO肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，將105例NSCLC分為鱗癌、貼壁狀腺癌、腺泡狀腺癌和實(shí)體狀腺癌，與105例NSCLC組織表型分類對(duì)應(yīng)見表3。

2.3 不同組織起源NSCLC與EGFR基因突變的相關(guān)性EGFR基因突變?cè)谥夤苌掀ぐ⒓?xì)支氣管肺泡癌及肺泡細(xì)胞癌中的檢出率分別為1.60%（8/50）、52.30%（23/44）、45.50%（5/11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。本研究中不同起源的NSCLC中EGFR突變位點(diǎn)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)：支氣管上皮癌中有EGFR18和21外顯子突變；肺泡細(xì)胞癌中檢測(cè)到EGFR20和21外顯子突變，未發(fā)現(xiàn)18和19外顯子的突變；相比之下，細(xì)支氣管肺泡癌中EGFR突變呈現(xiàn)多樣性，4種常見突變均被檢測(cè)到；在支氣管上皮癌中僅腺鱗癌表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見表4。

2.4 不同組織起源NSCLC生存分析 本研究共隨訪患者105例，失訪患者共19例。單因素生存結(jié)果分析顯示，支氣管上皮癌、細(xì)支氣管肺泡癌和肺泡細(xì)胞癌總體預(yù)后生存差別無顯著意義，當(dāng)把臨床分期作為分層因素時(shí)，在I期和II期肺泡細(xì)胞癌預(yù)后優(yōu)于細(xì)支氣管肺泡癌，而支氣管上皮癌預(yù)后最差，雖然P值均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P1=0.009,P2=0.075），但其差異已經(jīng)趨于顯著（IIIb期患者分組存在較大偏倚性，擬擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步分析），見表5、圖2。

表3 兩種肺癌組織學(xué)分類方法之間的對(duì)應(yīng)Tab 3 The correspondence between two types of histological classification

表4 不同組織起源NSCLC與EGFR基因突變相關(guān)性Tab 4 The correlation between NSCLC and EGFR gene mutation

表5 不同組織起源NSCLC單因素生存分析Tab 5 Analysis of the existence of NSCLC single factor for different tissue origin

3 討論

以組織學(xué)為基礎(chǔ)的WHO肺及胸膜腫瘤分類是目前臨床廣泛采用的肺癌分類體系，尤其是2015年版WHO肺癌分類[5,6]整合了放射、內(nèi)科、外科等多學(xué)科的視角，融合了肺腺癌的部分新的免疫表型信息和分子信息，具有較高的臨床實(shí)用性。但隨著臨床實(shí)踐的深化，WHO肺癌分類體系越來越顯現(xiàn)出其自身的局限性，主要表現(xiàn)在：腫瘤形態(tài)組織分類復(fù)雜，可重復(fù)性差；依據(jù)免疫標(biāo)記將肺癌分為鱗癌和腺癌兩大類，簡(jiǎn)單化的同時(shí)不可避免地出現(xiàn)片面性，部分腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)鱗癌和腺癌的標(biāo)記物，難做出明確的區(qū)分；WHO分類提供了有限的組織類型-分子表型信息；以上幾點(diǎn)導(dǎo)致WHO新分類指導(dǎo)臨床實(shí)踐的效能大打折扣。

我國(guó)著名病理學(xué)家李維華教授曾提出以組織發(fā)生（來自支氣管表面上皮、細(xì)支氣管肺泡上皮、神經(jīng)內(nèi)分泌、支氣管腺體）和組織表型（鱗癌、腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌）為基礎(chǔ)，聯(lián)系分化程度和結(jié)合免疫組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)特征的肺癌分化表型分類方案[7]。該分類方案體現(xiàn)了簡(jiǎn)明、系統(tǒng)和高度重復(fù)率的優(yōu)點(diǎn)。Yatabe[8]于2002年提出了終末呼吸單位（terminal respiratory unit, TRU）的概念，并在此概念指導(dǎo)下，根據(jù)組織起源不同將肺癌分為TRU型和非TRU型，兩型腺癌在臨床特點(diǎn)、組織結(jié)構(gòu)、免疫組化和基因突變等方面均有不同的特點(diǎn)，但該研究并未突出組織表型這一要素。

圖1 P63、NapsinA、CK7、TTF-1蛋白在NSCLC中的表達(dá)。A：CK7 (+)，TTF-1 (+)，(SP, ×200)；B：P63 (+)，NapsinA (+) (SP, ×200)；C：P63 (+)，NapsinA (-) (SP, ×200)；D：CK7 (+)，TTF-1 (-) (SP, ×200)；E：CK7 (-),TTF-1 (+)；F：P63 (-), NapsinA (+) (SP, ×200)。Fig 1 The expression of P63, NapsinA, CK7 and TTF-1 in NSCLC.A: CK7(+), TTF-1 (+), (SP, ×200); B: P63 (+), NapsinA (+) (SP, ×200); C: P63 (+),NapsinA (-) (SP, ×200); D: CK7 (+), TTF-1(-) (SP, ×200); E: CK7 (-), TTF-1(+); F: P63 (-), NapsinA (+) (SP, ×200).

組織發(fā)生部位是腫瘤的重要特征之一，主支氣管和肺由原基（肺芽）向各級(jí)氣管及肺泡分化的過程中存在特定表型特征的逐步關(guān)閉和表達(dá)，而這種變化又和部位存在一定關(guān)聯(lián)性。如在胚胎早期TTF-1的表達(dá)可見于大氣管的假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮中，而在發(fā)育成熟的個(gè)體中僅見于肺泡單位和遠(yuǎn)端呼吸性細(xì)支氣管中，可見肺癌的組織發(fā)生部位或組織起源代表了肺癌的表型和分化特征[9]。本研究中不同組織起源的肺癌與相對(duì)應(yīng)的正常肺組織免疫表型呈現(xiàn)高度的一致性；同時(shí)單因素生存分析顯示，臨床I期和II期的細(xì)支氣管肺泡癌患者的預(yù)后趨勢(shì)優(yōu)于支氣管上皮癌但低于肺泡細(xì)胞癌，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的患者在術(shù)后接受了放化療或靶向治療，目前基于順鉑為主的聯(lián)合治療方法多用于NSCLC患者不同階段的治療[10]。不同的臨床預(yù)后也從另一方面反映出不同起源NSCLC對(duì)于治療方案的選擇存在明顯差異。以上分析表明，本研究提出的肺癌分類不但具有很高的病理分類診斷價(jià)值，也具有重要的臨床治療指導(dǎo)意義。

圖2 不同臨床分期支氣管上皮癌、細(xì)支氣管肺泡癌和肺泡細(xì)胞癌生存曲線Fig 2 The survival curves of bronchial epithelial carcinoma, bronchial alveolar carcinoma and alveolar cell carcinoma

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑已被廣泛應(yīng)用于EGFR基因突變型的NSCLC[11,12]，并且已作為一線標(biāo)準(zhǔn)治療藥物列入相關(guān)治療指南[13,14]。本研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR基因在支氣管上皮癌、細(xì)支氣管肺泡癌及肺泡細(xì)胞癌中的突變率分別為1.60%、52.30%及45.50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），反映了本分類體系下腫瘤類型與分子表型具有較高的一致性；同時(shí)不同組織起源的NSCLC中EGFR突變位點(diǎn)呈現(xiàn)不同特點(diǎn)，以上具有重要的臨床提示意義，可以減少肺癌患者不必要的特定驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)，降低患者的醫(yī)療費(fèi)用和負(fù)擔(dān)；同時(shí)有利于重點(diǎn)篩查出適合靶向治療的患者，提高靶向治療的精準(zhǔn)度。

總之，本研究中提出的基于組織起源的NSCLC的分類可以提高臨床病理診治療和有效指導(dǎo)臨床治療，具有充分的理論意義和臨床實(shí)踐價(jià)值。