秦立鑫，張 琦

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

蜱屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda）、蛛形綱（Arachinda）、蜱螨目（Acarina）、蜱亞目（Ixodides）、蜱總科（Ixodoidae），主要分硬蜱科（Ixodidae）、軟蜱科（Argrasidae）、納蜱科（Nuttalliellidae）。

蜱是專(zhuān)性吸血的體表寄生蟲(chóng)，嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的健康，被蜱叮咬，可造成中毒、咬傷、驚擾和失血。此外，蜱還是傳播多種疾病，如萊姆病、森林腦炎、斑點(diǎn)熱、野兔熱、Q熱、蜱出血熱等，嚴(yán)重時(shí)，可直接或間接造成家畜和人類(lèi)的死亡。

萊姆?。↙yme disease）又稱(chēng)為萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是一種經(jīng)由蜱傳播的自然疫源性人獸共患病，因首次在美國(guó)康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)因此而得名萊姆病。萊姆病主要因?yàn)轵缍Ｒ?、獸而傳染，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要臨床表現(xiàn)有皮膚慢性游走性紅斑、腦膜炎、顱神經(jīng)炎、神經(jīng)根炎、關(guān)節(jié)炎、心臟炎等癥狀。病原體為伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），可分為13個(gè)基因型。1982年，Willy等在美國(guó)首次從肩突硬蜱中分離出伯氏疏螺旋體，我國(guó)于1986年首次發(fā)現(xiàn)該病在位于黑龍江省海林縣林區(qū)，之后相繼報(bào)道的病原有狹義伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi sensus stricto）、伽氏疏螺旋體（B.garinii）、阿氏疏螺旋體（B.afzelii）和法雷斯疏螺旋體（Borrelia valaisiana）共4個(gè)基因型。目前，我國(guó)至少存在6種不同基因型，包括阿氏疏螺旋體（B.afzelii）、伽氏疏螺旋體（B.garinii）、伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi sens utricto）、法雷斯疏螺旋體（B.valaisiana）、西尼伽疏螺旋體（B.sinica）和長(zhǎng)江疏螺旋體（B.yangtze）[1]。其中阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體屬于致病基因型。

該病呈現(xiàn)世界性分布，亞洲、歐洲、美洲、大洋洲、非洲的70多個(gè)已國(guó)家報(bào)道有該病發(fā)生，且發(fā)病區(qū)域在不斷擴(kuò)大，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。我國(guó)29個(gè)省（區(qū)、市）均有人患萊姆病的報(bào)道，而且每年新發(fā)病例高達(dá)上萬(wàn)余例。蜱是伯氏疏螺旋體的傳播媒介和貯存宿主，蜱通過(guò)叮咬吸血將病原體傳遞給人類(lèi)及動(dòng)物。我國(guó)地域遼闊，蜱的種類(lèi)繁多，并且因?yàn)榄h(huán)境等各方面因素不同，感染伯氏疏螺旋體情況也存在著較大的差異，因此探明蜱的種類(lèi)在該病的防治中具有重要意義。

黑龍江省海倫市一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)有著良好的生態(tài)環(huán)境，是重要的養(yǎng)殖園區(qū)。并且在此有被蜱叮咬的記錄，因此了解蜱感染伯氏疏螺旋體的情況，為萊姆病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 采集樣本

在黑龍江省海倫市一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)周?chē)捎貌计旆ú杉坞x蜱，鑒定分類(lèi)后低溫保存。

1.1.2 引物制備和方法

本試驗(yàn)采用嵌套PCR的方法檢測(cè)伯氏疏螺旋體。需進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。

第一輪擴(kuò)增時(shí)使用的引物：23S N1和C1，擴(kuò)增條件：94℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)。

23S N1：5'-ACC ATA GAC TCT TAT TAC TTT GAC-3'

C1：5'-TAA GCT GAC TAA TAC TAA TTA CCC-3'

第二輪擴(kuò)增時(shí)使用的引物：23S N2和5S CB，擴(kuò)增條件：94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，40個(gè)循環(huán)。

23S N2：5'-ACC ATA TCT TAT TAC TTT GAC CA-3'

5S CB：5'-GAG AGT AGG TTA TTG CCA GGG-3'

1.1.3 試驗(yàn)試劑

DNA 2 000 Marker、DNA聚合酶、引物、超純水、TAE、EB、瓊脂糖、dNTPs等。

1.1.4 主要儀器

振蕩器；電泳槽（北京君意東方制造）；Hws24水浴鍋（上海恒科儀器制造）；高速臺(tái)式離心機(jī)；PCR儀（TaKaRa）；小型離心機(jī)（江蘇海林市其林貝爾儀器制造）；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)；電泳儀（六一牌）；微波爐（美的牌）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取具體方法如下。

將蜱放入研缽內(nèi)（研缽在每次使用時(shí)須確保以充分洗凈，以防所提取的DNA被殘留的DNA污染），然后小心的倒入液氮，充分研磨至無(wú)較大的碎片為止。

加入450 μL裂解液至研缽內(nèi)與磨碎的蜱充分進(jìn)行混合，用移液槍轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。

向離心管內(nèi)加入20 μL蛋白酶K。加蛋白酶K時(shí)需要將槍頭深入離心管中，充分混合均勻后，封口，將離心管置于56℃的水浴鍋中過(guò)夜消化。

加450 μL苯酚（Tris平衡酚），注意苯酚分上下兩層，吸下層（先將槍頭插入再打氣），簡(jiǎn)短搖晃20下，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加225 μL氯仿及225 μL苯酚，搖晃20次，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加450 μL氯仿。搖晃20次，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加滿(mǎn)無(wú)水乙醇（低溫），-20℃冰箱保存20 h。

離心機(jī)預(yù)冷，12 000 r·min-1離心16 min，注意離心管放置角度一致。

將液體倒入新管中備用或棄掉，再將所得沉淀（DNA）?？墼诟蓛舻募埥砩?，5 min晾干。

加入1 000 μL 80%酒精清洗，洗脫鹽離子，震蕩，混勻。

12 000 r·min-1離心5 min。重復(fù)沉淀及晾干。加入100 μL TE，室溫環(huán)境放置約30 min，混勻。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)體系（25 μL體系）

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

取0.8 g瓊脂糖放入錐形瓶中，后加入90 mL TAE，用微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，冷卻至不感覺(jué)燙手時(shí)，再加入EB并充分的混和均勻，倒入準(zhǔn)備好的板中，待膠凝好后，即可進(jìn)行下一步操作。

取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入點(diǎn)樣孔中（勿點(diǎn)破凝膠），凝膠板中間的點(diǎn)樣孔中加入Mark以作參照。

點(diǎn)完樣之后，蓋上電板蓋并打開(kāi)電泳儀，運(yùn)行17 min（電泳條帶跑至4～5線(xiàn)間）即可停止，進(jìn)行照膠和記錄數(shù)據(jù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因的擴(kuò)增

以蜱DNA為模板，用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后所得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)226～266 bp的條帶（圖1、圖2），與預(yù)期相符。

通過(guò)PCR的結(jié)果對(duì)黑龍江省海倫市一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)的革蜱攜帶伯氏疏螺旋體情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表2所示，總檢出率為53.13%。其中一廠(chǎng)二礦的檢出率最高為64.58%；星火牧場(chǎng)的檢出率為41.67%。

2.2 基因測(cè)序

將伯氏疏螺旋體陽(yáng)性樣本從中挑選9份送去DNA測(cè)序，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3～6。

圖3中108號(hào)革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列經(jīng)測(cè)序分析大小為229 bp，BLAST比對(duì)結(jié)果顯示該蜱感染的伯氏疏螺旋體基因型與B.garinii基因型相識(shí)度為86%（圖4）。

圖1 一廠(chǎng)二礦革蜱的伯氏疏螺旋體部分檢測(cè)結(jié)果

圖2 星火牧場(chǎng)革蜱的伯氏疏螺旋體部分檢測(cè)結(jié)果

表2 革蜱伯氏疏螺旋體的感染情況

圖3 108號(hào)革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列結(jié)果

圖4 108號(hào)革蜱的BLAST對(duì)比結(jié)果

圖5中142號(hào)革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列經(jīng)測(cè)序分析大小為225 bp，BLAST比對(duì)結(jié)果顯示該蜱感染的伯氏疏螺旋體基因型與B.afzelii基因型相似度為99%（圖6）。測(cè)序結(jié)果顯示一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)的革蜱均有感染阿氏和伽氏兩種伯氏疏螺旋體基因型的情況，BLAST對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 142號(hào)革蜱伯氏疏螺旋體的基因測(cè)序結(jié)果

圖6 142號(hào)革蜱的BLAST對(duì)比結(jié)果

地點(diǎn)星火牧場(chǎng)一廠(chǎng)二礦伽氏疏螺旋體145 108、174、187阿氏疏螺旋體122、134、142、158 116

2.3 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

構(gòu)以測(cè)序獲得的伯氏疏螺旋體序列及GenBank上登錄的相關(guān)伯氏疏螺旋與B.afzelii在同一進(jìn)化分支上。表明這兩個(gè)地點(diǎn)革蜱均攜帶了B.garinii和B.afzelii兩種伯氏疏螺旋體，且攜帶率較高。如圖7所示。

圖7 進(jìn)化結(jié)果

3 討論

本次試驗(yàn)的96份樣品中檢測(cè)到51份含有伯氏疏螺旋體，總檢出率為53.13%。檢出率較高。這次試驗(yàn)表明一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)的革蜱攜帶伯氏疏螺旋體，其中一廠(chǎng)二礦的革蜱攜帶率最高，其次是星火牧場(chǎng)。

早在1986年，在我國(guó)黑龍江省海林縣林區(qū)便首次報(bào)道了萊姆病感染情況，并從中分離出伯氏疏螺旋體。在那之后，我國(guó)30多個(gè)?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）均有該病的報(bào)道出現(xiàn)，現(xiàn)已證實(shí)其中有19個(gè)存在萊姆病的自然疫源地。這一結(jié)果為該地區(qū)萊姆病的診斷防治提供了一定的依據(jù)，可以據(jù)此來(lái)幫助臨床診斷?，F(xiàn)已查明有多種野生動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)及家畜（牛、馬、犬等）可以作為本病的宿主，維持該病在自然界中的存在和持續(xù)循環(huán)[1]。嚙齒類(lèi)動(dòng)物是萊姆病的主要傳染源，因其分布廣、數(shù)量多、感染普遍。另外，鳥(niǎo)類(lèi)的遷徙為遠(yuǎn)距離傳播伯氏疏螺旋體創(chuàng)造了條件。因此，了解區(qū)域內(nèi)伯氏疏螺旋體的感染情況，檢測(cè)其宿主動(dòng)物的帶菌率是十分必要。對(duì)萊姆病傳播媒介和儲(chǔ)存宿主的控制有助于防控該病在我國(guó)的流行[2]。

生活在萊姆病自然疫源地及蜱蟲(chóng)存在地區(qū)的人有感染該病潛在可能。發(fā)病高峰期主要在夏末秋初。但是，由于地區(qū)之間存在著氣候差異，因此不同地區(qū)萊姆病流行的時(shí)間也存在一定的差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明，兩地點(diǎn)革蜱感染伯氏疏螺旋體阿氏和伽氏兩種基因型，這兩種基因型均屬于致病型。因此生活在牧場(chǎng)、林區(qū)及植被豐富地區(qū)的人應(yīng)注意對(duì)萊姆病的預(yù)防，如被蜱叮咬且出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚病變者，應(yīng)將萊姆病列入排查范圍,以防漏診、誤診。因此，場(chǎng)區(qū)應(yīng)做好防控工作以保護(hù)工作人員和畜禽的安全，應(yīng)采取一定的措施以防感染，注意定期殺蟲(chóng)。目前對(duì)萊姆病及其他蜱傳播的疾病的主要預(yù)防措施是定期殺蟲(chóng)，主要運(yùn)用殺蟲(chóng)劑來(lái)控制蜱的數(shù)量，但是這種方法會(huì)造成環(huán)境污染且容易出現(xiàn)抗藥性，同時(shí)對(duì)人和動(dòng)物存在一定的危險(xiǎn)。目前有效的措施既殺蟲(chóng)劑的使用，有針對(duì)性的干預(yù)和個(gè)人的防護(hù)等措施相互結(jié)合起來(lái)，預(yù)防萊姆病和其他蜱傳播的疾病。

本次試驗(yàn)為今后對(duì)其他地區(qū)伯氏疏螺旋體的研究，積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

4 結(jié)論

海倫市一廠(chǎng)二礦及星火牧場(chǎng)部分地區(qū)存在革蜱感染伯氏疏螺旋體的情況，并且感染率較高，感染基因型均屬于致病型，應(yīng)注意防范。