宋名楊 姜云飛 朱路文 吳孝軍 葉 濤 唐 強(qiáng)△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

新生兒缺血缺氧性腦?。℉IE）是新生兒在圍生期因?qū)m內(nèi)或?qū)m外缺氧所造成的腦部疾病，致死率較高，幸存者往往遺留智力、感官、運(yùn)動(dòng)等方面的神經(jīng)功能損害，給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來極大負(fù)擔(dān)［1］，因此尋找有效治療此病的手段尤為重要。目前我國治療此病的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法多為針灸治療，此法痛感明顯，患兒常不配合，為治療增加難度。舒筋健腦顆粒以水煎溫服為治法，以補(bǔ)氣活血為治則治療缺血缺氧性腦病，其操作簡單，易于家長及患兒接受，于臨床中療效顯著［2］，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)舒筋健腦顆?？上抡{(diào)一氧化氮、一氧化氮合酶及腫瘤壞死因子的表達(dá)，從而減輕腦組織缺血缺氧性損傷［3］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）與原癌基因TRK家族中的酪氨酸蛋白激酶B（TrKB）是一種滲透于神經(jīng)系統(tǒng)各種活動(dòng)的生物活性蛋白，具有促進(jìn)進(jìn)缺血缺氧腦損傷（HIBD）后腦組織的修復(fù)及再生的作用［4-6］。本研究觀察新生大鼠腦缺血缺氧后及舒筋健腦顆粒干預(yù)后腦組織海馬BDNF及TrKB的變化，探討舒筋健腦顆粒治療HIBD的相關(guān)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取48只平均體質(zhì)量于13.2～15.4 g之間、雌雄不限的7日齡清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠）黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)：SCXK （黑）2008001。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4個(gè)組，即空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組12只，并于造模后14、28 d時(shí)間點(diǎn)再分成兩個(gè)亞組（n=6）。各組大鼠可自由食水，室溫恒定于20～25℃，濕度保持50%～60%，明暗光照12 h晝夜循環(huán)，各組大鼠均于25日齡時(shí)與母鼠分離。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。舒筋健腦顆粒，組成：川椒3 g，千年健 10 g，炙黃芪 20 g，炒赤芍 10 g，炒川芎 6 g，當(dāng)歸 10 g，廣地龍 10 g，杜仲 10 g，石菖蒲 6 g，宣木瓜10 g，伸筋草15 g，雞血藤15 g組成，均為飲片（天江制藥公司），將飲片加入由0.9%氯化鈉注射液制成的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，溫水浴加熱約37℃，配制成混懸藥液備用（中藥低劑量組質(zhì)量濃度：每毫升含生藥1 g；中藥高劑量組質(zhì)量濃度：每毫升含生藥4 g）。2）儀器。一抗：均為兔抗大鼠，BDNF（wanleibo，WL0168，1∶500）、TrKB（wanleibo，WL00554，1∶300）多克隆抗體。二抗：羊抗兔（北京中杉金橋）。蛋白酶抑制劑Cocktail：（Ce1lSignaling Tech-nology）；DK-8D 型 H 孔電熱恒溫水槽（上海一恒）；PL303型電子天平（上海梅特勒托利多）；雙垂直蛋白電泳儀DYCZ-24DN（北京六一）；超速冷凍離心機(jī)H-2050R （長沙湘儀），8%O2+92%N2混合氣體（哈爾濱黎明氣體集團(tuán)）。

1.3 模型制備 參照Rice-Vannucci經(jīng)典方法建立新生大鼠HIBD動(dòng)物模型［7］。大鼠乙醚吸入麻醉，固定手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒后，左側(cè)頸部縱行切開暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈并分離，結(jié)扎兩端，中間剪斷，縫合皮膚，放入裝有母鼠糞便的墊料中2 h，隨后予以8%O2+92%N2混合氣體缺氧處理2 h。缺氧結(jié)束后，大鼠出現(xiàn)自發(fā)或夾尾左旋者證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱鞒晒Γ鼗\母乳喂養(yǎng)?？瞻捉M僅破皮暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合回籠母乳飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法 空白組：術(shù)后24 h予溫0.9%氯化鈉注射液灌胃（5 mL/kg），放置回籠，早晚各1次。模型組：術(shù)后24 h予溫0.9%氯化鈉注射液灌胃（5 mL/kg），放置回籠，早晚各1次。中藥低劑量組：術(shù)后24 h予低劑量濃度舒筋健腦顆?；鞈乙汗辔福? mL/kg），放置回籠，早晚各1次。中藥高劑量組：術(shù)后24h予高劑量濃度舒筋健腦顆?；鞈乙汗辔福? mL/kg），放置回籠，早晚各1次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）取材：各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)（造模后14、28 d），腹腔注入10%水合氯酸深度麻醉，于低溫環(huán)境下快速斷頭取腦，分離左側(cè)海馬組織［8］，0.9%氯化鈉注射液沖洗表面，箔紙包裹，置于標(biāo)本瓶中，液氮速凍后-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?）蛋白免疫印跡試驗(yàn) （Western blotting）法檢測各組大鼠海馬BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)。提取大鼠海馬蛋白，用Nanodrop測定樣品中蛋白濃度。根據(jù)BDNF和TrkB的分子量選擇SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將PVDF膜放入一抗封閉緩沖液中室溫?fù)u床震蕩1 h，分別加入BDNF、TrkB、β-actin抗體盒中，4℃過夜。PBS緩沖液漂洗3次，將PVDF膜分別放入加有羊抗兔二抗的抗體盒中，37℃孵育45min，ECL顯影。采集BDNF、TrkB及β-actin條帶灰度值，得到各樣本 BDNF、TrkB與β-actin的灰度比值。以空白組某一樣本相對(duì)表達(dá)量為1，其余樣本均較正后的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較選用單因素方差分析，兩兩間差異選用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF的Western blotting檢測結(jié)果 見表1、圖1。造模后14、28 d，模型組與空白組相比，大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)明顯升高 （P<0.05）；與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中藥高劑量組BDNF蛋白表達(dá)較中藥低劑量組高（P<0.05）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.05；與中藥低劑量組比較，●P＜0.05。 下同

組 別 n 14 d 28 d空白組 6 0.2350±0.01871 0.2783±0.02563模型組 6 0.3233±0.02944△ 0.4417±0.02137△中藥低劑量組 6 0.5333±0.02066*△ 0.6100±0.0200*△中藥高劑量組 6 0.7400±0.02098*△● 0.8200±0.02828*△●

2.2 各組大鼠海馬區(qū)TrkB的Western blotting檢測結(jié)果 見表2，圖2?？瞻捉M大鼠僅有少量TrkB蛋白表達(dá)；造模后14、28 d，與空白組比較，模型組大鼠海馬區(qū)TrkB蛋白表達(dá)增高（P<0.05）；與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠海馬區(qū)TrkB蛋白表達(dá)較明顯（P<0.05），與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組TrkB蛋白表達(dá)更明顯（P<0.05）。

圖1 各組14、28 d BDNF蛋白表達(dá)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)TrkB蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)TrkB蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n 14 d 28 d空白組 6 0.2150±0.01871 0.2583±0.01602模型組 6 0.3717±0.02714△ 0.4250±0.01871△中藥低劑量組 6 0.4533±0.018762*△ 0.5133±0.01506*△中藥高劑量組 6 0.6717±0.02317*△● 0.7200±0.01789*△●

圖2 各組14、28 d TrkB蛋白表達(dá)

3 討 論

舒筋健腦顆粒是根據(jù)清代醫(yī)家王清任醫(yī)方補(bǔ)陽還五湯加減得來，方中的赤芍、川芎配以當(dāng)歸活血化瘀，黃芪補(bǔ)氣扶正，并予以地龍、伸筋草等通筋活絡(luò)，將藥力行至全身，最終達(dá)到氣旺血行、瘀祛絡(luò)通的效果［9-11］。此方對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病標(biāo)本兼治，達(dá)到促進(jìn)缺血缺氧后腦組織修復(fù)的目的，并已應(yīng)用于臨床中，且療效顯著。

BDNF是一種可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)揮生理作用（生存、發(fā)育、分化、再生），維持神經(jīng)細(xì)胞代謝功能，增強(qiáng)中樞神經(jīng)的營養(yǎng)、支持、保護(hù)及功能表達(dá)的一種活性作用較強(qiáng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子［12］，在海馬區(qū)含量較多。TrkB是BDNF所必需的中介體，其胞內(nèi)含有酪氨酸蛋白激酶區(qū)（TK區(qū)），可以傳遞信號(hào)，反應(yīng)性引起細(xì)胞內(nèi)各信號(hào)通路活化，從而發(fā)揮BDNF的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)HIBD發(fā)生后，BDNF、TrkB蛋白在受損區(qū)高度表達(dá)，二者大量結(jié)合提升TrkB自身磷酸化的作用，刺激并活化Ras-MAPK通路，進(jìn)而于CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的絲氨酸位點(diǎn)促使CREB活化，維持神經(jīng)細(xì)胞存活并促進(jìn)其修復(fù)，而BDNF還可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化并遷移至受損區(qū)域替代受損的神經(jīng)元，這些作用相輔相成，共同抵御腦組織的缺血缺氧性損傷，修復(fù)受損神經(jīng)元，使神經(jīng)系統(tǒng)在解剖及功能上得到最大限度的恢復(fù)［13-16］。本實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)模型組BDNF、TrkB蛋白表達(dá)均較空白組增加，說明腦缺血缺氧可啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制促進(jìn)BDNF、TrkB的表達(dá)，保護(hù)及修復(fù)受損的神經(jīng)元；而各時(shí)間點(diǎn)中藥低劑量組及中藥高劑量組BDNF、TrkB的表達(dá)較模型組明顯增加，說明舒筋健腦顆?？梢栽谌毖毖醯臈l件下顯著調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF、TrkB的表達(dá)；各時(shí)間點(diǎn)，中藥高劑量組較中藥低劑量組的BDNF、TrkB蛋白表達(dá)較多，說明應(yīng)用高劑量的舒筋健顆粒在促進(jìn)腦組織修復(fù)及再生上可發(fā)揮更大作用。

綜上所述，舒筋健腦顆粒可延緩HIBD新生大鼠腦組織損傷并促進(jìn)其修復(fù)，其機(jī)制可能與舒筋健腦顆粒上調(diào)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)有關(guān)，且高劑量的舒筋健腦顆粒可促進(jìn)BDNF、TrkB蛋白更為明顯地表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及修復(fù)作用。