章 韻 王海嶸 費(fèi)愛華 高成金 鄭運(yùn)江

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200000）

急性腎損傷（AKI）是臨床常見疾病，長(zhǎng)期以來，缺乏有效的藥物治療手段。腎臟替代治療（RRT）是目前主要的治療措施［1-2］，但治療時(shí)機(jī)及劑量仍不明確，且作為有創(chuàng)治療，RRT存在風(fēng)險(xiǎn)大、治療費(fèi)用高昂等問題。且嚴(yán)重的AKI患者即使接受了RRT治療，其90 d的死亡率仍高達(dá)40%［3］。而早期改善可逆損傷是AKI治療的關(guān)鍵，因此迫切需要探尋一種創(chuàng)傷小、費(fèi)用低且療效顯著的治療方法。腎康注射液（SKI）是國(guó)家中藥二類新藥，由大黃、黃芪、紅花、丹參等中藥制成的復(fù)方制劑，近年來被廣泛用于慢性腎臟病的治療［4-6］，有文獻(xiàn)指出它能改善腎纖維化、慢性氧化應(yīng)激［7-8］，抑制腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生等［9-10］。一些臨床實(shí)例觀察到其可以改善急性腎損傷腎功能［11-12］，但缺乏證據(jù)說明它能否逆轉(zhuǎn)腎臟急性病理?yè)p傷，因此我們擬通過制備不同損傷程度（輕、中、重度）的缺血再灌注急性腎損傷模型，觀察SKI的干預(yù)作用并對(duì)機(jī)制做一簡(jiǎn)單探討。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠 40只，雄性，質(zhì)量 19～24 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：5CXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，自由進(jìn)水進(jìn)食。本研究獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器

1）試藥：腎康注射液，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040110，自西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司；肌酐、尿素氮、總超氧歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒自南京建成生物工程研究所；Cleved-Caspase3抗體、髓過氧化物抗體、免疫組化試劑盒自武漢谷歌生物科技有限公司；Triozol試劑自美國(guó)Invitrogen公司，Prime ScriptTMRT reagent試劑盒及SYBRTMPremix Ex TaqTM試劑盒自日本Takara公司。2）儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；高分辨顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500，美國(guó)ABI公司。

1.3 造模與分組

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、輕度損傷+SKI組、輕度損傷+普通生理鹽水組（NS）組、中度損傷+SKI組、中度損傷+NS組、重度損傷+SKI組、重度損傷+NS組?？瞻讓?duì)照組4只小鼠不造模，其余各組均為6只。C57BL/6小鼠購(gòu)買后于屏障環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)至8～12周，小鼠手術(shù)前晚禁食不禁水，參照文獻(xiàn)進(jìn)行輕、中、重?fù)p傷模型造模［13-15］，小鼠稱質(zhì)量后用10 mL/kg的5%水合氯醛麻醉，脫毛膏脫去腹部鼠毛，用寵物恒溫加熱毯，維持體溫于（37±1）℃，肛溫溫度計(jì)監(jiān)測(cè)肛溫，消毒皮膚后從腹中線開口進(jìn)入腹腔，腹腔撐開器撐開，小心撥開腸管，暴露雙側(cè)腎動(dòng)脈，輕、中、重?fù)p傷造模分別予動(dòng)脈夾對(duì)應(yīng)夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈15、25、45 min，然后移除血管夾，過程中可見腎臟由紅色變?yōu)榘咨笾饾u呈暗紅色，血流恢復(fù)后逐漸轉(zhuǎn)為紅色，術(shù)畢立即分別給予不同干預(yù)，最后用4號(hào)手術(shù)縫線逐層縫合關(guān)腹。24 h后小鼠麻醉下摘除眼球取血，然后頸椎脫臼處死，取右腎立即于4%多聚甲醛中固定，左腎保存于-80℃冰箱進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.4 干預(yù)方法

空白對(duì)照組不做任何處理。輕、中、重度損傷造模+SKI組給予10 mL/kg腎康注射液。輕、中、重度損傷造模+NS組給予10 mL/kg的0.9%氯化鈉注射液。各組用藥時(shí)間均為24 h。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

對(duì)各造模組進(jìn)行腎功能及組織病理指標(biāo)檢測(cè)，之后選擇腎功能及病理?yè)p傷改善組通過檢測(cè)氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等指標(biāo)對(duì)腎康注射液的藥理機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究。

1.5.1 Scr、BUN及組織SOD、MDA檢測(cè) 將取得的全血于高速離心機(jī)4℃，6000 r/min，離心20 min，取上清，用肌酐試劑盒（肌氨酸氧化酶法）及尿素氮試劑盒（脲酶法）按說明檢測(cè)。取腎組織加生理鹽水于組織研磨儀中研磨成勻漿后，用SOD試劑盒WST-1法）及MDA試劑盒（TBA法）檢測(cè)。

1.5.2 腎組織切片HE染色 腎組織于4%甲醛固定1 d后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)皮髓交界處壞死小管數(shù)及外髓部腎小管管型數(shù)，每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野（100倍）求平均值并統(tǒng)計(jì)。

1.5.3 腎組織切片免疫組織化學(xué)染色 取石蠟切片于不同濃度梯度二甲苯、乙醇中逐級(jí)脫蠟至水，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波法修復(fù)抗原，血清封閉后滴加Cleved-Caspase3抗體（1∶100稀釋）或髓過氧化物酶抗體（1∶100稀釋）于4℃冰箱過夜，洗滌后加二抗，室溫孵育60 min，再次洗滌，DBA顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，沖洗，中性樹脂封片，顯微鏡鏡下觀察拍照。凋亡評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化切片上凋亡小管占總腎小管數(shù)比例：＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分，觀察5個(gè)高倍鏡（×100倍）視野求平均值并統(tǒng)計(jì)。

1.5.4 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)炎癥因子表達(dá)

用Trizol試劑提取腎組織總RNA，用Prime ScriptTMRT reagent試劑盒，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模版與SYBRTMPremix Ex TaqTM試劑盒按步驟在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，評(píng)估各基因的擴(kuò)增效率。待測(cè)基因的相對(duì)定量計(jì)算公式為 2-△△ct［△△Ct=（Ct樣本目的基因-Ct樣本β-actin）-（Ct空白對(duì)照目的基因-Ct空白對(duì)照 βactin）］，并以 2-△△ct統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 PCR 引物序列 ：iNOS forward：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA，reverse：GTGGACGGGTCGATGTCAC；IL-6 forward：AGTCCGGAGAGGAGACTTCA，reverse：CAGTGCATCA TCGCTGTTCAT；β-actin forward：CATCCGTAAAGACC TCTATGCCAA，reverse：ATGGAGCCACCGATCCACA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Nonparametric Tests；多組比較，若滿足正態(tài)性及方差齊性，采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Scr和BUN水平比較

見表1。夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈 15 min、25 min、45 min對(duì)應(yīng)的損傷模型，各造模組血清肌酐水平對(duì)比空白組均顯著增高（P＜0.05）；且各損傷模型組之間肌酐水平存在明顯差異，符合輕、中、重?fù)p傷造模要求（P＜0.05）。輕度損傷造模+SKI組的Scr與輕度損傷造模+NS組比較，明顯下降（P＜0.05）；中度損傷造模+SKI組的Scr均數(shù)對(duì)比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但BUN之間無明顯差異 （P＞0.05）。重度損傷造模+SKI組比重度損傷造模+NS組，雖然Scr和BUN均有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組Scr和BUN水平比較（±s）

表1 各組Scr和BUN水平比較（±s）

與相應(yīng)程度損傷造模+NS組比較，*P＜0.05；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組 別 n Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）空白對(duì)照組 4 28.07±8.36 2.60±0.33輕度損傷造模+SKI組 6 92.28±12.90* 30.61±2.10輕度損傷造模+NS組 6 156.17±38.37△ 30.44±6.84中度損傷造模+SKI組 6 165.91±24.11* 28.72±2.84中度損傷造模+NS組 6 279.03±46.74△ 31.17±1.99重度損傷造模+SKI組 6 299.22±40.74 38.99±2.67重度損傷造模+NS組 6 339.01±25.99△ 39.10±1.26

2.2 各組腎組織病理?yè)p傷比較

見圖1。在空白對(duì)照組HE切片上可見腎小管間排列緊密、小管結(jié)構(gòu)完整、上皮細(xì)胞呈高柱狀，而各造模組中則均可見腎小管斷裂、小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性或扁平樣變、刷狀緣脫落、病理管型形成等。輕度損傷造模+SKI組在皮髓交界處少見壞死腎小管，輕度損傷造模+NS組則出現(xiàn)少量壞死小管。

中度、重度造模呈現(xiàn)大面積壞死，在HE切片上表現(xiàn)為均質(zhì)狀伊紅染色，細(xì)胞核消失；且髓質(zhì)部有病理管型形成。但在中度損傷中，中度損傷造模+SKI組壞死小管數(shù)為31.00/HP，與中度損傷造模+NS組的壞死小管數(shù)41.67/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)中度損傷造模+SKI組髓質(zhì)部病理管型為6.33/HP，中度損傷造模+NS組髓質(zhì)部病理管型為26/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組腎組織病例損傷比較 （HE染色，200倍）

2.3 輕度損傷組及空白對(duì)照組組織氧化應(yīng)激水平比較

見表2。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比腎功能及組織病理?yè)p傷改善情況，得出腎康注射液可以改善輕、中度的腎損傷，而對(duì)重度損傷無明顯作用，在此基礎(chǔ)上選取有治療作用的一組模型對(duì)其藥理作用進(jìn)行進(jìn)一步探究。通過檢測(cè)總SOD及MDA水平以反應(yīng)腎組織氧化應(yīng)激水平，輕度損傷+SKI組SOD值 較輕度損傷+NS組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MDA值則明顯下降（P＜0.01）。

表2 輕度損傷組及空白對(duì)照組SOD和MDA水平比較（±s）

表2 輕度損傷組及空白對(duì)照組SOD和MDA水平比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與輕度損傷造模+NS組比較，△P＜0.01。 下同

組 別 n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）空白對(duì)照組 4 120.99±5.98 3.39±0.35輕度損傷造模+SKI組 6 57.43±2.64**△ 6.82±2.20*△輕度損傷造模+NS組 6 33.01±6.00** 13.11±1.67**

2.4 輕度損傷組及空白對(duì)照組組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá)比較

見圖2，表3。在免疫組化切片中觀察到輕度損傷組術(shù)后給予SKI治療的腎臟組織切片棕色點(diǎn)較少，表示更少的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)檢測(cè)了相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)iNOS及IL-6表達(dá)同時(shí)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 輕度損傷組及空白對(duì)照組組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（免疫組化染色，200倍）

表3 輕度損傷組及空白對(duì)照組炎癥因子表達(dá)比較（2-△△ct，±s）

表3 輕度損傷組及空白對(duì)照組炎癥因子表達(dá)比較（2-△△ct，±s）

組 別 n IL-6 iNOS空白對(duì)照組 4 1.02±0.05 0.98±0.07輕度損傷造模+SKI組 6 4.05±1.78*△ 1.90±0.35△輕度損傷造模+NS 組 6 7.87±1.24** 4.52±1.40**

2.5 輕度損傷組及空白對(duì)照組凋亡腎小管比較

見圖3，表4。Clevaved-caspase-3是凋亡執(zhí)行酶，本實(shí)驗(yàn)將其作為細(xì)胞凋亡指標(biāo)［16］，免疫組化染色切片上可見細(xì)胞凋亡主要集中在外髓部位?？瞻讓?duì)照組凋亡評(píng)分為1分，輕度損傷+SKI組評(píng)分為 （1.90±0.39）分，與上輕度損傷+NS組凋亡評(píng)分（2.45±0.10）分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 輕度損傷組及空白對(duì)照組腎小管凋亡比較（免疫組化染色，200倍）

3 討 論

急性腎損傷（AKI）可進(jìn)展為急性腎衰竭或尿毒癥，嚴(yán)重危害人們的健康。根據(jù)2012年的改善全球腎臟病預(yù)后組織（KDIGO）標(biāo)準(zhǔn)［17］，將 AKI 定義為 48 h內(nèi)血清肌酐絕對(duì)值升高≥26.5 μmol/L或1周內(nèi)較基礎(chǔ)值升高 1.5倍或尿量<0.5 mL/（kg·h）超過 6 h。缺血后溫復(fù)流是經(jīng)典的急性腎損傷模型，損傷同樣集中與腎小管，且根據(jù)缺血時(shí)間的不同呈現(xiàn)輕、重不一的損傷。本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上調(diào)整雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉時(shí)間制備不同損傷程度的小鼠模型，并在損傷24 h后觀察各指標(biāo)，有文獻(xiàn)指出缺血再灌注損傷24 h時(shí)為損傷較嚴(yán)重時(shí)間點(diǎn)［18］。在輕度、中度損傷模型組中SKI干預(yù)后小鼠Scr下降，提示腎功能的改善，這種血清肌酐的下降在臨床病人中同樣也觀察到，但是否存在腎臟病理?yè)p傷的逆轉(zhuǎn)，臨床病例很難獲取腎組織標(biāo)本以供進(jìn)一步探究，而在小鼠模型中可以進(jìn)行進(jìn)一步研究。

不同時(shí)長(zhǎng)缺血組HE切片上呈現(xiàn)出不同程度的損傷，在輕、中度模型組中SKI干預(yù)后可見腎小管的壞死情況改善，且這種改善量化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而重度損傷模型出現(xiàn)大面積壞死，SKI干預(yù)與NS干預(yù)間無差異，同樣Scr值也無差異，這提示藥物作用的局限性，在較嚴(yán)重的患者中有必要及時(shí)采取更有效的治療措施。

據(jù)此，筆者得出腎康注射液可以改善缺血再灌注腎損傷的小鼠的腎功能并部分逆轉(zhuǎn)腎臟病理?yè)p傷，并在此基礎(chǔ)上選擇有所改善的模型組做了進(jìn)一步的機(jī)制探究，腎臟缺血時(shí)組織細(xì)胞因供氧供能不足發(fā)生損傷，當(dāng)血流恢復(fù)時(shí)中性粒細(xì)胞等急性期炎癥細(xì)胞也隨之進(jìn)入組織，組織呈現(xiàn)出高氧化應(yīng)激狀態(tài)，活性氧、炎癥因子、ATP缺乏等因素又繼續(xù)加重缺血后損傷。因而缺血再灌注損傷是一個(gè)較復(fù)雜的過程，實(shí)驗(yàn)同時(shí)選取了幾組指標(biāo)觀察SKI能否改善這一損傷過程。在組織SOD及MDA的檢測(cè)中SKI干預(yù)組體現(xiàn)了較低的氧化應(yīng)激水平，且中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)也較少，文中給出了代表性的對(duì)比結(jié)果，同時(shí)我們觀察到中性粒細(xì)胞主要浸潤(rùn)在壞死組織（切片上呈均質(zhì)無結(jié)構(gòu)染色）周圍，這與SKI干預(yù)組呈現(xiàn)較少的壞死小管一致。此外我們檢測(cè)了腎組織炎癥因子的表達(dá)，其中iNOS及IL-6的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而iNOS及IL-6是急性期促炎因子，可加重炎癥反應(yīng)。同時(shí)在腎小管凋亡也有所改善，而凋亡是小管死亡的不同形式，并與小管新生相關(guān)。

但是實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了各模型組BUN的值，SKI干預(yù)后均無改善，這可能與影響B(tài)UN的因素較復(fù)雜有關(guān)，Sik Lee等一項(xiàng)同樣通過缺血再灌注損傷造模的實(shí)驗(yàn)中，予保護(hù)性干預(yù)后，Scr改善同時(shí)同樣未見BUN改善［19］，且KDIGO標(biāo)準(zhǔn)中也未將BUN納入SKI診斷及分層標(biāo)準(zhǔn)。

綜上，我們實(shí)驗(yàn)從組織病理等角度證實(shí)SKI可以逆轉(zhuǎn)一定程度的急性腎損傷，同時(shí)也回答了針對(duì)較嚴(yán)重的損傷其作用有限，這提示在臨床工作中應(yīng)及早干預(yù)閾值，及早行RRT治療。