梅永超，李婷婷*，劉 楠，王當(dāng)豐，赫彬彬，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌細(xì)胞間交流的一種通訊機(jī)制，具有QS機(jī)制的細(xì)菌通過(guò)感知環(huán)境中低分子質(zhì)量、可擴(kuò)散的信號(hào)分子來(lái)調(diào)控菌體密度，并在信號(hào)分子達(dá)到閾值時(shí)啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)菌的生理行為，以適應(yīng)環(huán)境的變化[1-2]。研究表明，細(xì)菌的相關(guān)腐敗特性，如生物被膜的形成、胞外蛋白酶、嗜鐵素的產(chǎn)生等均依賴于QS系統(tǒng)的調(diào)控[3]。溫和氣單胞菌是魚(yú)類等水產(chǎn)品低溫貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的腐敗菌之一，且能夠產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）來(lái)調(diào)控其生物特性的表達(dá)[4-5]，以QS信號(hào)分子為靶點(diǎn)來(lái)阻斷QS系統(tǒng)已成為水產(chǎn)品防腐保鮮的一種新策略。阻斷或干擾細(xì)菌QS機(jī)制，主要有以下3 種途徑[6-7]：抑制信號(hào)分子的合成，如利用三氯生抑制合成AHLs前體物質(zhì)的酶活力；降解信號(hào)分子活性，如利用內(nèi)酯酶水解AHLs的內(nèi)酯環(huán)，或利用?；D(zhuǎn)移酶水解AHLs的酰氨鍵；干擾信號(hào)分子與受體蛋白的結(jié)合，如合成信號(hào)分子結(jié)構(gòu)類似物與信號(hào)分子受體蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。其中，QS抑制劑（QS inhibitors，QSIs）是指那些可以阻斷細(xì)菌種內(nèi)或種間信息交流，對(duì)細(xì)菌QS現(xiàn)象具有抑制或干擾作用的物質(zhì)。目前，已發(fā)現(xiàn)的QSIs多存在安全性問(wèn)題，且難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

天然植物精油提取工藝成熟、原料來(lái)源廣泛，且具有安全、無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)。從天然植物精油中尋找QS抑制劑日益受到人們的關(guān)注[8-9]。如Myszka等[10]發(fā)現(xiàn)百里香精油可有效抑制熒光假單胞菌KM121 QS現(xiàn)象及其生物被膜的形成。綠薄荷，亦稱留蘭香，為唇形科（Labiatae）薄荷屬（Mentha）直立多年生芳香草本植物，是世界上主要的香料植物之一，原產(chǎn)于南歐，在我國(guó)一些省份大面積種植[11]。綠薄荷精油是將其新鮮莖、葉等地上植株經(jīng)水蒸氣蒸餾而得的一種天然的、淡黃或黃綠色澄清的油狀液體。其化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要成分包括香芹酮、檸檬烯、蒎烯、月桂烯、桉葉油素、3-辛醇、薄荷酮等[12]。綠薄荷精油在日化、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13]。在食品工業(yè)中，它是一種重要的調(diào)味香料和食品添加劑，常用于糖果（口香糖）、煙酒、冰淇淋等產(chǎn)品。此外，有研究表明，綠薄荷精油具有良好的抗菌、抗氧化作用[14]，可用作天然食品防腐保鮮劑，在果蔬[15]、牛奶[16]中已有報(bào)道。但目前綠薄荷精油作為QS抑制劑的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以綠薄荷精油為研究對(duì)象，探討綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌QS及其腐敗特性的抑制效果，為綠薄荷精油更廣泛的利用提供理論參考，同時(shí)也對(duì)豐富和創(chuàng)新水產(chǎn)品貯藏保鮮理論、提高水產(chǎn)品品質(zhì)具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紫色桿菌Chromobacterium violaceum 026（CV026）為C. violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，卡那霉素抗性，僅當(dāng)存在外源AHLs時(shí)，菌株CV026產(chǎn)生特征性紫色色素。供試菌溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），從腐敗大菱鲆中分離、鑒定。兩種菌株均為生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心保藏，在28 ℃、160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。

綠薄荷精油（含50%～70%香芹酮） 長(zhǎng)沙冠香日化貿(mào)易有限公司；卡那霉素、冰醋酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、十二烷基硫酸鈉、正丁醇、醋酸異戊酯、乙酸乙酯 天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；結(jié)晶紫 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；載玻片 江蘇飛舟玻塑有限公司；鋅片 上海邁砷化工有限公司；LB肉湯（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH（7.0±0.1））、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH（7.0±0.2）） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；imark酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；80i顯微鏡 日本尼康公司；SS-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；7890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；W-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌活性及QSIs檢測(cè)

最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)：菌株CV026與溫和氣單胞菌過(guò)夜活化兩次后，按2%接入量接種于新鮮LB肉湯中（培養(yǎng)菌株CV026的LB肉湯中需含有20 μg/mL卡那霉素），160 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h，與100 mL LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，將200 μL不同劑量的綠薄荷精油（2、4、6、8 μL/mL和10 μL/mL）加到孔中。將平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株的產(chǎn)生情況。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為陰性對(duì)照。

QSIs檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：菌株CV026過(guò)夜活化兩次后，按2%接入量接種于含有20 μg/mL卡那霉素的新鮮LB肉湯中，160 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h，與100 mL含有20 μg/mL C6-HSL（信號(hào)分子）LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，將200 μL不同劑量的綠薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）加到孔中。將平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液作為陰性對(duì)照。

1.3.2 紫色菌素產(chǎn)量的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]，菌株CV026過(guò)夜活化后，按1∶100（V/V）接種于含有不同劑量綠薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）的LB肉湯中，并加入20 μg/mL C6-HSL，160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)立不加信號(hào)分子的實(shí)驗(yàn)組，以測(cè)定綠薄荷精油對(duì)菌株CV026生長(zhǎng)情況的影響。

依次吸取300 μL添加信號(hào)分子實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min離心5 min，吸取200 μL紫色上清液添加到96 孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液為陰性對(duì)照。

1.3.3 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜形成的影響

1.3.3.1 酶標(biāo)板法測(cè)定生物被膜

參考文獻(xiàn)[18]，將過(guò)夜活化的溫和氣單胞菌分別與新鮮LB培養(yǎng)液按1∶100（V/V）混勻后，取1 mL分裝至無(wú)菌的離心管中，加入終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的綠薄荷精油，以加入等體積的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液為陰性對(duì)照，等體積20 μg/mL C6-HSL為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測(cè)定其菌液密度后，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌水清洗3 次，無(wú)菌風(fēng)干燥固定35 min，隨后加入1 mL 0.1 g/100 mL的結(jié)晶紫染色15 min（室溫下），用無(wú)菌水清洗干凈，溶解于體積分?jǐn)?shù)33%冰醋酸溶液中，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm。生物被膜相對(duì)生成率按公式（1）計(jì)算。

式中：OD595nm實(shí)驗(yàn)組為某一實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的生物被膜的OD595nm；OD595nm陰性對(duì)照組為陰性對(duì)照組測(cè)得的生物被膜的OD595nm。

1.3.3.2 光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察生物被膜

載玻片（普通載玻片，25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預(yù)處理：置于體積分?jǐn)?shù)2%鹽酸溶液中浸泡24 h后，用蒸餾水洗凈、烘干，滅菌備用。

鋅片（純度≥99.0%，厚度0.20 mm）預(yù)處理：將鋅片用拋光機(jī)打磨去除表面氧化層后，切割成10 mm×10 mm大小，然后放入無(wú)水乙醇中超聲15 min，再放入去離子水中超聲15 min，然后烘干，滅菌備用。

在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入10 mL含有1%溫和氣單胞菌菌液的LB肉湯，并分別加入終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的綠薄荷精油，混合均勻后放入處理后的載玻片或鋅片，28 ℃靜置培養(yǎng)72 h。同時(shí)，設(shè)立不添加綠薄荷精油的陰性對(duì)照組和添加C6-HSL信號(hào)分子的陽(yáng)性對(duì)照組。

光學(xué)顯微鏡觀察：72 h后取出載玻片，無(wú)菌水沖洗，除去浮游菌及黏液，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入適量甲醇固定15 min，再加入適量2%結(jié)晶紫溶液染色5 min后，用無(wú)菌水沖洗干凈，25 ℃下進(jìn)行干燥，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

掃描電子顯微鏡觀察：72 h后取出鋅片，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～5 次，將鋅片放入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出后，梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇脫水，再經(jīng)醋酸異戊酯置換兩次，自然干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[19]，制作牛奶瓊脂平板，用牛津杯打孔，加入含有不同劑量（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）綠薄荷精油過(guò)夜培養(yǎng)的溫和氣單胞菌菌液，28 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h。蛋白酶水解酪蛋白后，在孔周圍出現(xiàn)明顯的水解圈，水解圈越大，胞外蛋白酶活力越高。以不加綠薄荷精油的菌液為陰性對(duì)照，以添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理3 個(gè)平行，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其直徑。

1.3.5 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌群集和泳動(dòng)的影響

參考文獻(xiàn)[20]，將綠薄荷精油經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后，與冷卻至40 ℃群集的瓊脂培養(yǎng)基（1%蛋白胨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，下同）、0.5%氯化鈉、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖）和泳動(dòng)的瓊脂培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.3%瓊脂）混勻，倒平板，使平板中綠薄荷精油的終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL，向冷卻的平板中央加入5 μL過(guò)夜活化兩次的溫和氣單胞菌菌液，無(wú)菌風(fēng)吹干，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察測(cè)試菌的遷移情況。以不加綠薄荷精油的菌液為陰性對(duì)照，以添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理3 個(gè)平行。

1.3.6 GC-MS定量分析綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌產(chǎn)AHLs的影響

AHLs粗提液的制備：將活化好的溫和氣單胞菌接種于含有200 mL LB肉湯的錐形瓶中，分別搖床培養(yǎng)（28 ℃、160 r/min）12、24、36 h和48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用等體積酸化乙酸乙酯（含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸溶液）提取兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干有機(jī)溶劑（35 ℃，真空度0.1 MPa），用1 mL甲醇溶解殘留物，-20 ℃保存?zhèn)溆?。綠薄荷精油處理組LB肉湯中需含有2 mg/mL的綠薄荷精油，其余操作同上。

定量方法：AHLs粗提液采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。選擇與AHLs具有相似結(jié)構(gòu)（內(nèi)酯環(huán)）且待測(cè)粗提取液中不能檢出的AHLs標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)物。經(jīng)前期研究[21]發(fā)現(xiàn)，溫和氣單胞菌不分泌C14-HSL，因此統(tǒng)一添加2 μL 2 mg/mL的C14-HSL標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為內(nèi)標(biāo)物到各組粗提取液（1 mL）中，在離子檢測(cè)（m/z 143）模式下對(duì)粗提取液中的AHLs進(jìn)行定量研究，計(jì)算公式如式（2）所示。

式中：C1為樣品中Cn-HSL的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；S1為樣品中Cn-HSL對(duì)應(yīng)的峰面積。

制作含有6 種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（溶劑為甲醇，質(zhì)量濃度200 μg/mL），GC-MS檢測(cè)，確定各類型標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。

GC-MS條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為高純度氦氣，流速為l mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；升溫程序：初溫150 ℃，以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持7 min；接著以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；最終以0.5 ℃/min升溫至252.5 ℃，保持5 min。進(jìn)樣量1 μL，溶劑延遲3 min，分流進(jìn)樣，分流比50∶1，運(yùn)行總時(shí)間18 min。電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。選擇離子檢測(cè)（m/z 143）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果及QSIs活性

圖 1 綠薄荷精油對(duì)紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色素的抑制活性Fig. 1 Inhibitory activity of spearmint oil on violacein production of CV026

通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)綠薄荷精油劑量為2、4、6、8、10 μL/mL時(shí)，對(duì)菌株CV026的最小抑菌劑量為4 μL/mL。隨后對(duì)溫和氣單胞菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在相同劑量范圍內(nèi)，綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌并無(wú)抑菌作用。因此選取亞抑菌劑量（4 μL/mL以下劑量）的綠薄荷精油進(jìn)行QSIs檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置實(shí)驗(yàn)劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL。圖1表示在亞抑菌劑量下，綠薄荷精油對(duì)紫色桿菌CV026 QS活性的影響。從圖中可以看出添加綠薄荷精油的孔徑周圍出現(xiàn)白色、渾濁、不透明的抑制圈，表明綠薄荷精油具有抑制菌株CV026產(chǎn)生特征性紫色素的能力。

2.2 紫色菌素定量分析

通過(guò)酶標(biāo)法測(cè)定菌株CV026紫色菌素產(chǎn)量，其相對(duì)下降量可反映綠薄荷精油對(duì)菌株CV026 QS現(xiàn)象的抑制程度。如圖2所示，隨著綠薄荷精油劑量的升高，菌株CV026紫色菌素產(chǎn)量呈劑量依賴性下降。與未添加精油相比，當(dāng)綠薄荷精油劑量為2.0 μL/mL時(shí)，菌株CV026紫色菌素產(chǎn)量的下降率達(dá)56.17%。同時(shí)，研究不同劑量下綠薄荷精油對(duì)菌株CV026生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，綠薄荷精油并未對(duì)菌株CV026菌液密度造成影響，進(jìn)而說(shuō)明其并未抑制菌株CV026的生長(zhǎng)代謝，而是通過(guò)干擾菌株CV026的QS系統(tǒng)，使其紫色菌素的產(chǎn)生受到了抑制。

圖 2 不同劑量綠薄荷精油對(duì)紫色桿菌CV026紫色菌素產(chǎn)生和菌液密度的影響Fig. 2 Effect of spearmint oil on violacein production of CV026

2.3 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜形成的影響

2.3.1 酶標(biāo)板法測(cè)定生物被膜

生物被膜指微生物為適應(yīng)生存環(huán)境而附著于生物或非生物物質(zhì)接觸表面，利用多糖基質(zhì)將自身包裹而形成的一種聚集體膜樣物。生物被膜廣泛存在于由金屬、塑料、玻璃等各類材料制成的食品機(jī)械設(shè)備表面，難以徹底清除，且極易導(dǎo)致食品微生物污染，從而造成嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)損失[22]。Aswathanarayan等[23]研究表明，微生物生物被膜的形成受QS系統(tǒng)調(diào)控。因此，本研究通過(guò)干擾QS系統(tǒng)為靶點(diǎn)來(lái)控制生物被膜的形成。從圖3可以看出，以空白組為基準(zhǔn)（生物被膜相對(duì)生成率100%），添加C6-HSL信號(hào)分子的陽(yáng)性對(duì)照組生物被膜相對(duì)生成率明顯增高，進(jìn)一步說(shuō)明溫和氣單胞菌生物被膜生成受QS系統(tǒng)的調(diào)控。此外，隨著綠薄荷精油劑量的增大，該菌株生物被膜生成率隨之減小，而菌液密度未受影響。這說(shuō)明，綠薄荷精油可通過(guò)干擾、抑制QS系統(tǒng)來(lái)調(diào)控溫和氣單胞菌生物被膜的生成，且未對(duì)菌株有致死或抑制作用。

圖 3 不同劑量綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜生成率的影響Fig. 3 Effect of spearmint oil on biofilm formation of Aeromonas sobria

2.3.2 光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察生物被膜

圖 4 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜影響的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 4 Optical micrographs of Aeromonas sobria biofilm

由圖4a、b可見(jiàn)，經(jīng)染色的菌體緊密相連形成大片的紫色膜狀物，且添加C6-HSL信號(hào)分子的陽(yáng)性對(duì)照組，還出現(xiàn)局部菌體聚集成具有層次感的深紫色團(tuán)狀物；對(duì)比綠薄荷精油處理組（圖4c～f），經(jīng)結(jié)晶紫染色后，隨著添加劑量的升高，菌體難以在載體上牢固附著、易被沖散，未見(jiàn)菌體聚集形成大片紫色膜狀物，僅有少量菌體相連且膜狀物分布稀疏。

利用掃描電子顯微鏡可清晰直觀地觀察生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的變化。

圖 5 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜影響的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscopic images of Aeromonas sobria biofilm

如圖5a、b所示，菌體被胞外聚合物層層包裹形成復(fù)雜的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并覆蓋整個(gè)載體表面，單一菌體難以顯現(xiàn)。添加C6-HSL信號(hào)分子的陽(yáng)性對(duì)照組，生物被膜形態(tài)更為致密。

圖5c～f為綠薄荷精油處理組，隨著綠薄荷精油劑量的升高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)退化并逐漸解體，胞外聚合物明顯減少且僅有少量菌體被包裹其中。據(jù)此，推測(cè)綠薄荷精油可通過(guò)抑制胞外聚合物形成，來(lái)減弱溫和氣單胞菌的成膜能力。

2.4 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響

溫和氣單胞菌是魚(yú)類等水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗菌，具有分泌蛋白水解酶的能力。其致腐機(jī)理是利用蛋白酶水解水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及游離氨基酸，促進(jìn)自身生長(zhǎng)繁殖，從而加速腐敗進(jìn)程，導(dǎo)致水產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)劣變，甚至產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[24]。葛靜慧等[25]發(fā)現(xiàn)降解海參優(yōu)勢(shì)腐敗菌消化嗜冷桿菌（Psychro-bacter alimentarius）的AHLs可阻斷其蛋白酶的產(chǎn)生。趙麗珺等[26]研究發(fā)現(xiàn)冷卻豬肉中常見(jiàn)的產(chǎn)蛋白酶的腐敗菌（假單胞菌和沙雷氏菌）均受AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控。

圖 6 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響Fig. 6 Effect of spearmint oil on protease activity of Aeromonas sobria

如圖6所示，當(dāng)外源C6-HSL信號(hào)分子存在時(shí)，蛋白酶水解圈顯著增大。添加綠薄荷精油使蛋白酶水解圈直徑明顯減小，且水解圈直徑與綠薄荷精油劑量呈負(fù)相關(guān)。這表明溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力受QS系統(tǒng)調(diào)控，且綠薄荷精油可通過(guò)干擾QS系統(tǒng)，調(diào)控溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生。

2.5 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌群集和泳動(dòng)的影響

群集和泳動(dòng)是細(xì)菌在接觸表面遷移的兩種方式，群集運(yùn)動(dòng)特指發(fā)生在大于0.45%的瓊脂上的表面遷移，而泳動(dòng)則指發(fā)生在小于0.45%的瓊脂培養(yǎng)基上的遷移[27]。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性被證實(shí)在定植到宿主表面及后繼形成生物被膜的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。Merritt等[29]認(rèn)為耶爾森鼠疫桿菌的泳動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)受通過(guò)QS系統(tǒng)調(diào)控的生物表面活性劑的影響。Daniels等[30]還發(fā)現(xiàn)QS系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)節(jié)群集細(xì)胞的分化、鞭毛基因的合成及細(xì)菌表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生而參與到不同種類細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)。

圖 7 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌群集、泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)的影響Fig. 7 Effect of spearmint oil on swarming and swimming motility of Aeromonas sobria

圖 8 綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌運(yùn)動(dòng)區(qū)直徑的影響Fig. 8 Effect of spearmint oil on diameter of the motility zone of Aeromonas sobria

從圖7、8中可以看出，添加C6-HSL信號(hào)分子的陽(yáng)性對(duì)照組較空白組菌株的運(yùn)動(dòng)性明顯增強(qiáng)。綠薄荷精油的添加與溫和氣單胞菌群集和泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)特性呈負(fù)相關(guān)，且有一定的劑量依賴性。這與Merritt[29]和Daniels[30]等的研究結(jié)果相一致，且與2.3節(jié)中綠薄荷精油對(duì)生物被膜的抑制作用呈現(xiàn)一致性。

2.6 GC-MS定量分析綠薄荷精油對(duì)溫和氣單胞菌產(chǎn)AHLs的影響

圖 9 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品GC譜圖Fig. 9 GC of mixed AHLs standards

從圖9可以看出，各峰分離良好，峰形尖銳呈對(duì)稱狀，C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL在設(shè)定時(shí)間內(nèi)完全分離，保留時(shí)間分別為4.408、6.254、8.305、10.685、13.374、16.882 min。

由表1可以看出，0～12 h，溫和氣單胞菌分泌AHLs主要是C8-HSL和C12-HSL，24～48 h為C4-HSL和C8-HSL；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，C8-HSL的分泌量一直較高。在菌株生長(zhǎng)初期（0～12 h）菌株分泌的信號(hào)分子不僅種類少且質(zhì)量濃度很低；隨著菌株的生長(zhǎng)（12 h以后），信號(hào)分子的種類逐漸增加，質(zhì)量濃度也急劇上升，同時(shí)長(zhǎng)鏈的信號(hào)分子C12-HSL不再出現(xiàn)，其原因可能是隨著菌株的生長(zhǎng)和培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，pH值升高導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生改變，從而導(dǎo)致長(zhǎng)鏈的信號(hào)分子內(nèi)酯環(huán)斷裂。與空白組對(duì)比，經(jīng)綠薄荷精油處理的實(shí)驗(yàn)組信號(hào)分子的種類未發(fā)生變化，但其質(zhì)量濃度明顯下降，說(shuō)明綠薄荷精油能夠抑制溫和氣單胞菌QS信號(hào)分子的分泌。

3 結(jié) 論

本研究利用紫色桿菌CV026作為QS現(xiàn)象檢測(cè)對(duì)象，驗(yàn)證了綠薄荷精油在亞抑菌劑量下對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)的抑制作用。結(jié)果表明，綠薄荷精油具有降低菌株CV026產(chǎn)紫色菌素的能力，其劑量為2 μL/mL時(shí)，對(duì)紫色菌素的抑制率達(dá)56.17%；溫和氣單胞菌某些與腐敗相關(guān)的生物特性（生物被膜、胞外蛋白酶活力、泳動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)）均受

到QS系統(tǒng)的調(diào)控，添加一定劑量的綠薄荷精油能夠達(dá)到抑制這些生物特性表達(dá)的目的，且隨著劑量的增加，其抑制效果更趨明顯。此外，GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，綠薄荷精油能夠有效抑制溫和氣單胞菌分泌AHLs。因此，綠薄荷精油具有良好的QS抑制活性，可作為新型的QS抑制劑用于水產(chǎn)品防腐保鮮。但是，目前綠薄荷精油對(duì)QS系統(tǒng)信號(hào)分子分泌、受體蛋白的結(jié)合以及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的抑制機(jī)理還未明晰，需要進(jìn)一步研究。