谷怡靜

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061100）

曲霉廣泛分布于空氣、土壤、谷物和各類生物中，在一定的濕度和溫度條件下，會(huì)引起食品的霉變。曲霉毒素是真菌毒素中首先發(fā)現(xiàn)的一種，文中談到的黃曲霉毒素就是曲霉毒素中最重要的一種。1960年，英國倫敦郊區(qū)發(fā)生的“火雞X病”使黃曲霉毒素首次被發(fā)現(xiàn)，其常見于谷物和糧油制品的污染。由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)烈的致癌性，嚴(yán)重威脅了人類健康，所以研究食品中黃曲霉毒素的污染并對(duì)食品中黃曲霉毒素含量的檢測十分必要。

1 黃曲霉毒素的分布與結(jié)構(gòu)

1.1 黃曲霉毒素的分布

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉污染食品后滋生的一種強(qiáng)力毒素。這2種霉菌在自然界中普遍存在，尤其是在花生、玉米和小麥等植物性的食物中多見。黃曲霉毒素對(duì)食品的污染及污染程度因地域、季節(jié)、作物生長、儲(chǔ)存的條件不同而不同。在南方高溫高濕等環(huán)境中，春夏兩季黃曲霉毒素中毒頻繁發(fā)生，而華北等北方地區(qū)，除個(gè)別樣品外，一般樣品中檢測不到黃曲霉毒素。

1.2 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)

黃曲霉毒素是具有相似結(jié)構(gòu)的多種毒素化合物的總稱，每種化合物在其基本結(jié)構(gòu)中均含有雙氫呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)４笾驴煞譃锽類和G類，以及其在人體內(nèi)羥基化后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物M類。在這些類型中，黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強(qiáng)、致癌性最強(qiáng)。

AFB1的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 AFB1的分子結(jié)構(gòu)式

2 黃曲霉毒素的產(chǎn)生與理化性質(zhì)

2.1 黃曲霉毒素的產(chǎn)生

產(chǎn)生黃曲霉毒素的最適溫度11～37℃，相對(duì)濕度80%～85%，pH值在4.0以下。當(dāng)溫度處于24～30℃時(shí)，能產(chǎn)生黃曲霉毒素的最低相對(duì)濕度83%，并且在這種條件下黃曲霉菌的產(chǎn)毒量達(dá)到最高。當(dāng)霉菌處于氧氣含量充足、低溫、有微量元素的含糖量高的物質(zhì)中并且與其他霉菌競爭激烈時(shí)，黃曲霉可以在2 d內(nèi)快速生長并產(chǎn)出黃曲霉毒素。

黃曲霉毒素對(duì)農(nóng)作物的污染一般集中在其還未成熟期，即在田間生長階段。當(dāng)作物收獲后由于不良的貯藏條件或所處環(huán)境濕度較高，會(huì)導(dǎo)致霉菌爆發(fā)，從而使農(nóng)作物被毒素污染。這些霉菌廣泛存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，特別是以花生和核桃中最為嚴(yán)重。通常情況下，水分高于14%最適合黃曲霉的繁殖和生長。

2.2 黃曲霉毒素的理化性質(zhì)

黃曲霉毒素在適當(dāng)?shù)淖贤夤庹丈湎掳l(fā)射高強(qiáng)度熒光。黃曲霉毒素水溶性極差，難溶于水且?guī)缀醪蝗苡诩和椤⑹兔?、乙醚等溶劑。但溶于甲醇、油、丙酮、二甲基甲酰等有機(jī)溶劑中。黃曲霉毒素的熱穩(wěn)定性較好，不易受熱分解，分解溫度高達(dá)280℃，想要使其失活必須通過長時(shí)間的高溫作用（即溫度達(dá)到100～120℃后持續(xù)加熱），例如高壓消毒和煅燒。若想要進(jìn)一步破壞毒素的活性，也可用NaOH萃取其中的游離脂肪酸。

3 黃曲霉毒素的殘留限量

一般來說，毒素能否對(duì)人類的身體健康造成危害取決于毒素在所食品中所占比例。黃曲霉毒素B1是到目前為止發(fā)現(xiàn)的具備最大毒性的一種真菌毒素，因此對(duì)黃曲霉毒素的許可殘留量進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定：規(guī)定大米和食用油中黃曲霉毒素的允許殘留量不得超過10μg/kg，其他食品、豆類及發(fā)酵食品中不得超過5μg/kg，嬰兒代乳食品（配方奶粉）中不得檢出黃曲霉毒素。WTO（世界衛(wèi)生組織） 給出建議：食品和飼料中黃曲霉毒素的最大殘留量不應(yīng)超過15 μg/kg。

我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的黃曲霉毒素的允許量[1]見表1。

表1 我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的黃曲霉毒素的允許量

4 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素為高毒性，有研究表明，其毒性相當(dāng)于砒霜（砷）的68倍，敵敵畏的100倍，會(huì)對(duì)人體和動(dòng)物的肝臟、腎臟造成極大的危害，并可能使人體器官發(fā)生癌變，有很大的幾率引發(fā)腫瘤。

4.1 急性慢性中毒

黃曲霉毒素主要作用于肝臟并直接抑制DNA，RNA和肝臟蛋白質(zhì)的合成。急性中毒后會(huì)有肝出血、肝臟損傷等現(xiàn)象，并使中毒者食欲明顯減弱從而導(dǎo)致體重下降、生長緩慢，如果長時(shí)間中毒未處理則會(huì)伴隨抽搐、過度興奮等癥狀。若是由于持續(xù)攝入微量毒素而引起的慢性（亞急性） 中毒可以對(duì)動(dòng)物的生長造成障礙或使肝臟出現(xiàn)慢性損傷等癥狀。

4.2 致癌性

黃曲霉毒素可誘發(fā)肝癌的發(fā)生。其誘發(fā)肝癌是通過人體長期攝入少量或短期攝入大量毒素造成的。其中以AFB1的致癌能力最強(qiáng)，AFG1和AFM1次之。王慶峰等人[2]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙型肝炎病毒的攜帶者或大部分吸煙者發(fā)生黃曲霉毒素中毒時(shí)，這2種疾?。ú《九c毒素）會(huì)發(fā)生協(xié)同作用，使肝癌的發(fā)生率明顯增高。

4.3 其他毒性

在其他毒性中，以胚胎毒性最為嚴(yán)重。當(dāng)黃曲霉毒素對(duì)肝臟造成直接傷害后，可導(dǎo)致遺傳基因畸變，致畸胎或死胎。

5 黃曲霉毒素的檢測方法

近幾年來，隨著黃曲霉毒素研究方法的不斷完善，檢測技術(shù)的靈敏度與檢測結(jié)果的精密度不斷提高，出現(xiàn)了許多快速檢測方法。主要有薄層色譜分析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、免疫化學(xué)分析法和生物傳感器技術(shù)。這些新方法和新技術(shù)的廣泛應(yīng)用與發(fā)展使得人們在檢測黃曲霉毒素方面有了更多的選擇。針對(duì)檢測的不同目的與要求可以更好地選擇所適用的技術(shù)。

5.1 薄層色譜分析法（TLC）

目前，國內(nèi)大部分檢測機(jī)構(gòu)都采用薄層色譜法檢測黃曲霉毒素，這也是國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法。唐志峰等人[3]認(rèn)為這種方法是依據(jù)分子分離的方式檢測的，主要是利用儀器作為基礎(chǔ)設(shè)備進(jìn)行掃描，以獲取其中的黃曲霉毒素含量，這是基于傳統(tǒng)視覺檢測方法不斷改進(jìn)和創(chuàng)新的結(jié)果。其基本原理是用適當(dāng)?shù)妮腿臉悠分休腿〕鯝FB1，濃縮、純化并在薄層板（色譜）上展開層析、分離，接著在紫外光下激發(fā)顯色，利用AFT的熒光性進(jìn)行定量判斷。根據(jù)樣品在紫外光下的熒光點(diǎn)的強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光點(diǎn)相比，以此來確定黃曲霉毒素在樣品中的含量是否超標(biāo)，為半定量分析方法。這種分析方法的優(yōu)點(diǎn)是所需設(shè)備簡單、操作方便，一般的檢測實(shí)驗(yàn)室即可完成測定。缺點(diǎn)是樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、測定的干擾因素多，所得結(jié)果的準(zhǔn)確性差、誤差較大。最重要的一點(diǎn)是該方法的最低檢出限為5μg/kg，與國標(biāo)上的毒性安全劑量0.01μg/kg[4]相比所需試劑量過多，所以這種檢測方法會(huì)間接對(duì)操作人員的身體造成傷害，已經(jīng)逐漸被其他方法替代。

5.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜（HPLC）是一種利用液體作為流動(dòng)相的新型液相色譜檢測技術(shù)。該方法已被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外黃曲霉毒素的檢測中。步驟一般分為提取、凈化和檢測。其原理是樣品經(jīng)凈化后，在適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相下，使用反相C18色譜柱，根據(jù)分離組分在流動(dòng)相和固定相中的溶解度不同而將樣品中的AFT分離出來，達(dá)到分離目的。根據(jù)分離情況的不同可形成一定的色譜峰，通過測量色譜峰的面積從而做到對(duì)AFT的定量分析[5]。李紅梅等人[6]通過加入標(biāo)液從而得到峰面積與濃度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并發(fā)現(xiàn)AFB1在5～100 ng/mL線性關(guān)系比較穩(wěn)定，如果信噪比3為標(biāo)準(zhǔn)，則HPLC對(duì)AFB1的檢出限為1 ng/mL。趙群等人[7]利用此方法測定玉米中的黃曲霉毒素時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣品中峰全部出完僅需5 min，耗時(shí)非常短并且測出當(dāng)加標(biāo)測定玉米中的黃曲霉毒素時(shí)，玉米樣品加標(biāo)回收率可達(dá)到93.9%～104.4%。孟之航等人[8]更是由此方法檢測了20多種堅(jiān)果，其中都未發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素，而玉米被黃曲霉毒素污染的程度高達(dá)36%。高效液相色譜法檢測結(jié)果誤差小、靈敏度高、操作方便、數(shù)據(jù)可靠，但是儀器、試劑比較昂貴。現(xiàn)在人們正在不斷的研究此方法，使這個(gè)方法可以運(yùn)用更加廣泛。

TLC與HPLC 2種方法的比較[9]見表2。

表2 TLC與HPLC 2種方法的比較

5.3 免疫化學(xué)分析法

5.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA） 是基于20世紀(jì)70年代開發(fā)的免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)的微觀檢測技術(shù)。其原理是抗體吸附在固相載體上以形成酶反應(yīng)板的孔。然后將酶標(biāo)記的抗原和樣品混合物加入酶反應(yīng)板的孔中，引起特定的免疫反應(yīng)以形成具有酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物。最后，將這種酶的底物加入小孔中進(jìn)行顯色反應(yīng)。比較顯色反應(yīng)完成后樣品出現(xiàn)的顏色與標(biāo)準(zhǔn)品的顏色的深淺，從而判斷出樣品中待測物（即黃曲霉毒素）的含量[10]。ELISA及其試劑盒可用于定性和定量的檢測。Liu D等人[11]用ELISA檢測試劑盒檢測了生牛奶中黃曲霉毒素的含量并對(duì)試劑盒的原理與檢測結(jié)果進(jìn)行了更完整的描述和說明。該方法靈敏度高、費(fèi)時(shí)短、特異性較強(qiáng)、不用接觸有毒樣品，最低檢出限為0.02μg/kg[12]。不過也有缺點(diǎn)，此方法所用的酶容易受外界條件的影響，外界條件的改變可能會(huì)使檢測的結(jié)果不準(zhǔn)確，而且如果對(duì)樣品的前處理不適當(dāng)，容易出現(xiàn)假陽性或陰性結(jié)果，同時(shí)ELISA試劑也需要低溫保藏否則會(huì)影響檢測結(jié)果。

5.3.2 放射免疫分析法（RIA）

放射免疫分析法與酶聯(lián)免疫吸附法的原理基本相同，不同的是RIA所用的標(biāo)記物為放射性元素而ELISA所用的標(biāo)記物是酶。放射免疫分析法的檢測結(jié)果具有高度特異性和靈敏性、儀器檢測快速精確、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化。但由于其標(biāo)記物是放射性元素，所以長時(shí)間使用此方法檢測會(huì)對(duì)接觸到放射性元素的人們身體健康造成極大危害，目前這種方法也逐漸被其他更好的方法所替代，不再廣泛應(yīng)用。5.3.3 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析技術(shù)（Immune colloidal gold technique）是基于抗原和抗體特異性結(jié)合的一種快速檢測的固相膜免疫分析技術(shù)。其原理是樣品中游離的抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合。如果樣品中沒有待測抗原，則游離金標(biāo)抗體將與固定在膜上的半抗原特異性結(jié)合形成紅色帶，測試結(jié)果為陰性；如果含有待測抗原，則游離抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，其可抑制固定在膜上的半抗原與金標(biāo)抗體的結(jié)合。隨著樣品中待測抗原含量的升高，所形成的紅色條帶變淺，樣品中待測抗原的含量與條帶顏色的深淺成反比，檢測結(jié)果呈陽性。由于該方法操作簡便、所需檢測時(shí)間短、靈敏度高，所以常應(yīng)用于大批量樣品的快速現(xiàn)場檢測和實(shí)驗(yàn)室樣品的初步篩選，具有可觀的發(fā)展前景。目前，已經(jīng)研發(fā)出了一種用于快速定量檢測黃曲霉毒素的膠體金檢測試劑盒。宋青龍等人[13]用膠體金快速檢測試劑盒檢測了玉米中黃曲霉毒素的含量，并分析了試劑盒檢測方法，利用試劑盒檢測不同濃度的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)結(jié)果的特異性發(fā)現(xiàn)了每種檢測到的毒素含量均小于2μg/kg，證明了檢測黃曲霉毒素的試劑盒與玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）等均不出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

5.3.4 金標(biāo)免疫層析法（GICA）

金標(biāo)免疫層析技術(shù)（Gold labeled immunochromatographic assay，GICA） 也被人們稱為金標(biāo)試紙法，它是基于膠體金免疫層析技術(shù)開發(fā)的單克隆抗體設(shè)計(jì)的固相免疫分析方法。使用納米金作為標(biāo)記物可以在短時(shí)間內(nèi)測定樣品中的AFT含量，并且可以得到直觀、準(zhǔn)確的結(jié)果。該方法不需要分離結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物，從而省去了許多繁瑣的預(yù)處理步驟。趙曉聯(lián)等人[14]對(duì)此方法進(jìn)行了一定的分析，利用不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素的標(biāo)液測定出金標(biāo)試紙的最低檢出限為2.5 ng/mL，并指出金標(biāo)試紙?jiān)?7℃條件下可保存7 d，4℃條件下可保存10個(gè)月左右。結(jié)果的重復(fù)性好，AFB1單克隆抗體與AFB2，AFG2交叉反應(yīng)率分別為7.14%和6.25%，交叉率較低。金標(biāo)試紙法的靈敏度高，不需要儀器設(shè)備之間復(fù)雜的相互配合，檢測亦可隨時(shí)隨地進(jìn)行。孫秀蘭等人[15]提出鹽、重金屬離子和油脂對(duì)金標(biāo)試紙檢測影響較大，其中重金屬的影響程度為Fe3+＞Cu2+＞Pb2+＞As3+，而對(duì)于一些含鹽較高的物質(zhì)為了使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確，一般在檢測前先進(jìn)行脫鹽處理。該方法定性檢測黃曲霉毒素的準(zhǔn)確度超過85%，靈敏度為4 ng/mL。此外，樣品中黃曲霉毒素的檢出限可達(dá)到20 ng/g[16]。當(dāng)下，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，金標(biāo)試紙法漸漸被人們接受并廣泛應(yīng)用。

5.3.5 免疫親和柱-熒光分光光度法

熒光分光光度法原理是以免疫親和柱作為分離手段，將樣品通入免疫親和柱，樣品中的AFT可在免疫親和柱的作用下進(jìn)行凈化、富集。免疫親和柱將高選擇性地選擇吸附樣品中的AFT并讓其他雜質(zhì)通過，然后用極性有機(jī)溶劑洗脫下來被吸附的AFT，即可進(jìn)行定量檢測。將洗脫的凈化液與碘液或溴水進(jìn)行反應(yīng)，使AFB1和AFG1衍生成具有高熒光活性的穩(wěn)定的物質(zhì)，然后利用熒光光度計(jì)，在一定條件下即可測出樣品中AFT含量。這樣檢測出的結(jié)果精密度較高，平均回收率較好，但其所用到的儀器價(jià)格都比較昂貴、操作有些繁瑣，所以在實(shí)驗(yàn)室中不經(jīng)常使用此方法。

5.4 生物傳感器

生物傳感器是基于生物技術(shù)和電子技術(shù)的復(fù)雜儀器，使用生物組件作為傳感器的主要功能元件。包括4個(gè)部分：即生物識(shí)別元件、轉(zhuǎn)換元件、機(jī)械元件和電氣元件組成。檢測的原理是使待測樣品中的抗原（即黃曲霉毒素） 與由抗體（或抗原） 與轉(zhuǎn)換器構(gòu)成的傳感器上的生物識(shí)別元件的特異性抗體反應(yīng)，以形成抗原抗體的特異性結(jié)合物，結(jié)合物的量的多少可由轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成不同強(qiáng)度的電信號(hào)，根據(jù)電信號(hào)的強(qiáng)弱變化，可檢測出樣品中黃曲霉毒素的含量。林海等人[17]進(jìn)行了一系列研究后提出這種生物傳感器的專一性較強(qiáng)，只能與特定的底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后傳出信號(hào)，不會(huì)受到樣品內(nèi)在因素的干擾（如樣品的顏色、濁度等），分析速度快、精度高，誤差可減小到1%。王亞楠等人[18]提出生物傳感器檢測AFT的LOD為0.25μg/kg，范圍為0.25～4.0μg/kg。目前，生物傳感器測定AFT的方法還不夠成熟，難以實(shí)現(xiàn)大批量的檢測，需要進(jìn)一步的完善。

6 黃曲霉毒素的預(yù)防與控制

黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，巴氏消毒也不能徹底殺滅黃曲霉毒素。Cui X等人[19]通過試驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論，測出AFT在雞（動(dòng)物）體內(nèi)主要沉積在肝臟與腎臟，在食用前加熱也不易去除，并且指出沉積在動(dòng)物體內(nèi)的這些毒素會(huì)隨食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，人類通過長時(shí)間的攝入即可引起慢性毒性，對(duì)人們的健康會(huì)造成損害。

一般的安全防控措施包括：將花生、大豆、稻谷、小麥等在貯藏前應(yīng)迅速降至其水分含量達(dá)8%～13%或以下，并貯藏于干燥的地方（相對(duì)濕度75%以及室溫10℃以下）；貯藏期間注意通風(fēng)防潮；降低食物表面環(huán)境的氧氣濃度；加強(qiáng)糧食，大豆等糧油農(nóng)產(chǎn)品的貯藏和銷售和售前檢驗(yàn)；化學(xué)方法防霉，加入一些防霉劑（如溴甲烷，二氯乙烷）；豆類、谷類應(yīng)洗凈后烹煮；挑選出霉變的糧食顆粒（加堿淘洗再搓洗）；適當(dāng)?shù)奶砑右恍A性物質(zhì)，或者用紫外光照射進(jìn)行去毒。

7 結(jié)語

黃曲霉素會(huì)對(duì)人體健康造成非常嚴(yán)重的危害。因此，黃曲霉毒素的檢測方法和限量必須得到更多關(guān)注和發(fā)展，中國還應(yīng)制定更為嚴(yán)格的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，特別是在免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)方面的不斷發(fā)展，已經(jīng)研發(fā)建立起了許多既快速又簡便，同時(shí)特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測方法。但是，現(xiàn)有的AFT檢測方法有利有弊，所以在測定AFT含量時(shí)可結(jié)合多種方法進(jìn)行測定，得出最為準(zhǔn)確明了的數(shù)據(jù)。