常青，彭暄

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

蓮子又稱蓮籽、蓮米、蓮肉、蓮蓬子，是睡蓮科植物蓮的成熟種子[1]。蓮子有四大品系，主要分布在我國(guó)的福建、湖北、湖南、浙江、江蘇、河北等地，有3000多年的種植歷史，其中以湖南湘蓮、福建建蓮、浙江衢蓮為上品，福建建寧和江西廣昌分別作為“中國(guó)建蓮之鄉(xiāng)”和“中國(guó)白蓮之鄉(xiāng)”[2]。多糖是一類由多個(gè)單糖基通過(guò)糖苷鍵結(jié)合的方式形成的天然大分子物質(zhì)，是生物體內(nèi)除核酸、蛋白質(zhì)以外的又一類重要生物分子[3]。

多糖最常用的提取方法為水提醇沉法，此方法提取的多糖常常含有較多雜質(zhì)（如蛋白、色素等），所以需要對(duì)提取得到的多糖進(jìn)行分離純化[4]。為了能到達(dá)一個(gè)最佳的脫蛋白的效果，通常將酶法脫蛋白與sevag法脫蛋白聯(lián)用[5]。多糖的純化通常采用柱層析法，常用的凝膠填料有Sephadex和Sepharose兩種。陳嬋[6]采用水提法提取蓮子多糖，但是提取率較低，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)超聲波對(duì)蓮子多糖的提取具有強(qiáng)化作用，微波對(duì)蓮子多糖的提取具有輔助作用。

但是超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本文主要研究超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝，通過(guò)酶法脫蛋白結(jié)合sevag法脫蛋白和經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后冷凍干燥獲得純化的蓮子多糖。通過(guò)考察不同的酶解溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、酶解時(shí)間（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL），得到蛋白酶酶解的最佳工藝，通過(guò)sevag法對(duì)酶法脫蛋白后的多糖進(jìn)一步脫蛋白，得到sevag法脫蛋白的最佳工藝。將脫蛋白后的蓮子多糖過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱，用全波段紫外-可見(jiàn)光光譜掃描，對(duì)純化后的多糖進(jìn)行純度鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶，索萊寶生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)染液、正丁醇、苯酚、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純；DEAE-52纖維素、Sephadex G-20葡聚糖凝膠為美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

DHL-A恒流泵：上海金朋分析儀器有限公司；

UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；

丹瑞HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴搖床：尤尼柯（上海）儀器有限公司；

玻璃層析柱（Φ16mm×400mm）：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蓮子多糖的制備

取適量去心干蓮子于植物粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)40目篩，得蓮子粉末樣品。取5 g蓮子粉末，置于鹵素快速水分測(cè)定儀中測(cè)定粉末樣品的水分含量，所制得蓮子粉末的水分含量小于3%。取蓮子粉末樣品于錐形瓶，按液料比55 mL/g的比例加入二次蒸餾水，在超聲波功率110 W和微波功率110 W的條件下提取70 s，樣品浸提液離心（4000 r/min，20 min）得濾液，加入4倍體積的常溫?zé)o水乙醇，室溫下靜置沉降20 h后，再次離心（4000 r/min，20 min）。棄上清液，取沉淀，用二次蒸餾水溶解沉淀后冷凍干燥，得蓮子多糖。

2.2 多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚比色法來(lái)測(cè)定蓮子多糖[7]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：分別配制8、16、24、32、40 g/mL的葡萄糖溶液，分別吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，依次加入濃度為6%的苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，顯色后于冷水中冷卻15 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，空白對(duì)照用蒸餾水做試劑空白。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

表明在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)葡萄糖溶液濃度與吸光度OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

X--表示葡萄糖溶液濃度，單位mg/mL；

Y--表示吸光度OD值。

2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制[8,9]：采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行顯色測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL加到試管中。加入考馬斯亮藍(lán)染液5.0 mL，混勻后室溫下靜置3 min，以試劑空白作對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光值。

樣品的測(cè)定：配制1 mg/mL的蓮子多糖溶液，吸取樣品液1.0 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的步驟測(cè)定吸光值，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)的濃度。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0066x+0.0092，R2= 0.9994。表明濃度在0～0.1 mg/mL的范圍內(nèi)牛血清蛋白溶液的濃度與吸光度值的線性關(guān)系良好（見(jiàn)圖1）。

2.4 脫蛋白試驗(yàn)

2.4.1 酶法脫蛋白

2.4.1.1 單因素試驗(yàn)

取蓮子多糖粉末0.5 g，用蒸餾水溶解，定容至500 mL，以蛋白質(zhì)的脫除率為指標(biāo)，考察不同的酶解溫度（20、30、40、50、60、70℃）、酶解時(shí)間（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL）蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響。

2.4.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)，綜合考慮酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶添加量（C）對(duì)除蓮子多糖中蛋白質(zhì)的脫除率的影響。

2.4.2 Sevag法

Sevag試劑的配制：將氯仿和正丁醇按照4∶1的比例配制。

取酶解脫蛋白后的蓮子多糖樣品液30 mL，加入10mL的Sevag試劑，用恒溫水浴搖床振蕩（200 r/min）20～30 min，離心（4000 r/min）20 min，取少量上清液測(cè)定蛋白質(zhì)和多糖的含量，然后將溶液反復(fù)處理5次。按公式計(jì)算多糖損失率和蛋白脫除率。

M1：脫蛋白后的多糖含量（mg）

M2：脫蛋白前的多糖含量（mg）

C1：脫蛋白后的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

C2：脫蛋白前的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

2.5 DEAE-52纖維素柱分級(jí)

參照Z(yǔ)eng等[10]的方法進(jìn)行稍加修改，將預(yù)處理后的DEAE-52纖維素填裝于1.6 cm×60 cm的層析柱中，柱高40 cm。用去離子水配制濃度為30 mg/mL蓮子多糖溶液，取10 mL加入DEAE-52纖維素柱上層析分級(jí)。0～19管用蒸餾水洗脫、20～120管用0～1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速：30 mL/h，4 mL/管。

2.6 Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱分級(jí)蓮子多糖

將預(yù)處理好的Sephadex G-20葡聚糖凝膠填裝于1.6 cm×40 cm的層析柱中，柱高30 cm。將DEAE-52纖維素柱分離的組分單次上樣10 mL，樣品濃度30 mg/mL。用NaCl溶液（0.1 mol/L）洗脫，流速：20 mL/h，每管4 mL，總共收集80管。用苯酚-硫酸法測(cè)定，在490 nm處用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)隔管測(cè)吸光度值后，作洗脫曲線。收集吸收峰部分的蓮子多糖，洗脫液氯化鈉用透析法除去，將透析后的蓮子多糖溶液濃縮冷凍干燥，即得分離的組分。

2.7 紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析

分別取脫蛋白后和過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖5 mg用蒸餾水溶解后定容至100 mL，用紫外-可見(jiàn)光譜進(jìn)行全波段掃描，掃描波長(zhǎng)間隔為0.5 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 蓮子多糖脫蛋白試驗(yàn)

3.1.1 酶法脫蛋白

3.1.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1.1.1 不同酶解溫度對(duì)蓮子多糖蛋白質(zhì)脫除率的作用

從圖2可知，溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，蛋白脫除率不斷上升，這可能是因?yàn)闇囟壬撸傅幕盍υ龃?，酶解速度加快[11]；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，蛋白脫除率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度后，酶蛋白質(zhì)發(fā)生變性，酶的活力下降，酶解速度下降[12]。因此，酶解溫度選擇50℃。

圖2 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的作用

3.1.1.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)蓮子多糖蛋白脫除率的作用

從圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間為40～60 min 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率不斷上升，60 min后蛋白脫除率幾乎不變。這可能是因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，酶與底物接觸充分，蛋白質(zhì)脫除率增大，反應(yīng)時(shí)間太短，酶解不充分[13]；當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定時(shí)，底物濃度降低，酶反應(yīng)達(dá)到飽和，蛋白的脫除效果受酶解時(shí)間的作用不大[14]。因此，最佳酶解時(shí)間為60 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白脫除率的作用

3.1.1.1.3 不同酶添加量對(duì)蓮子多糖蛋白脫除率的作用

從圖4可知，當(dāng)酶添加量在80～120 U/mL范圍時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率隨著酶添加量的增加而增加；當(dāng)酶添加量超過(guò)120 U/mL時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槎嗵侨芤褐械牡鞍踪|(zhì)，作為蛋白酶的作用底物，隨著酶濃度的增加，酶反應(yīng)速率加快，蛋白質(zhì)脫除效果不斷上升[15]；但是當(dāng)酶濃度升高到一定程度時(shí)，蛋白酶的酶解底物不足，酶反應(yīng)速率降低[5]。因此，最適酶添加量為120 U/mL。

圖4 酶量對(duì)蛋白脫除率的作用

3.1.1.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

3.1.1.2.1 因素水平表

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)，綜合考慮酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)3因素、3水平的正交試驗(yàn)表（表1）。

3.1.1.2.2 蓮子多糖脫蛋白最佳工藝條件的確定

蛋白酶酶法脫蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，比較Rj值得大小，RC＞RB＞RA，即在所設(shè)定的因素中，C因素對(duì)蛋白質(zhì)脫除的作用最大，其次是B因素，A因素。對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行直觀分析，將K值進(jìn)行比較可知，A2B3C2為優(yōu)水平組合，即酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為70 min，木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL時(shí)，蛋白質(zhì)的脫除率最大。

表1 正交試驗(yàn)因數(shù)和水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由表3可知，B和C因素作用顯著，A因素作用不顯著，所以需對(duì)酶解時(shí)間B和酶添加量C因素的各水平進(jìn)行多重比較。

多重比較的結(jié)果以B1、B3和C2為最好，根據(jù)實(shí)際情況，B因素選擇B1，由于A因素不顯著，故根據(jù)實(shí)際情況A因素選擇第1水平，由方差分析和多重比較可得出優(yōu)方案為A1B1C2。由于與正交試驗(yàn)中的優(yōu)水平組合不一致，需做進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果為：組合A1B1C2蛋白質(zhì)的脫除率為74.25%，由驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果可得此次試驗(yàn)的最優(yōu)方案為A1B1C2，此時(shí)，多糖的損失率為5.88% 。

表4 B因素各水平均值多重比較

表5 C因素各水平均值多重比較

3.1.2 Sevag法脫蛋白

經(jīng)蛋白酶處理后的蓮子多糖，采用sevag法做進(jìn)一步的處理，蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率情況如圖5所示。

圖5 Sevag試劑處理結(jié)果

從圖5可知，sevag法脫蛋白2次后，蛋白質(zhì)脫除率到達(dá)最大，多糖損失率不斷上升。綜上，最佳方案為sevag法脫蛋白2次，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率分別為85.5%和7.5%。

3.1.3 最佳工藝的確定

蓮子多糖的最佳脫蛋白工藝為：酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間50 min、木瓜蛋白酶添加量120 U/mL，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率和多糖的損失率分別為74.25%和5.88%。再用sevag試劑處理2次，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為85.5%，多糖損失率為7.5%。

3.2 蓮子多糖的梯度洗脫

蓮子多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱線性洗脫分級(jí)得到單一組分LSPs-1（如圖6所示），這與陳嬋[6]的結(jié)果一致。將35-58管收集經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后得到純化后的蓮子多糖，經(jīng)測(cè)定該組分的回收率為90.18%，說(shuō)明蓮子多糖已基本洗脫出來(lái)。

采用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析對(duì)經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化后蓮子多糖作進(jìn)一步的分離純化試驗(yàn)。經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化后的單一組分用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線如圖7所示，經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后得到更純的蓮子多糖LSPs-1-1。

圖7 蓮子多糖P1的Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線

3.3 純度鑒定

從圖8可知，脫蛋白后的蓮子多糖在280 nm處無(wú)明顯的吸收峰，相比脫蛋白前的蓮子多糖吸收峰小得多，說(shuō)明經(jīng)過(guò)酶法和sevag法脫蛋白后蓮子多糖中的蛋白質(zhì)已基本被除凈。

圖8 脫蛋白前后紫外-可見(jiàn)光譜全波段掃描圖

圖9 過(guò)柱后紫外-可見(jiàn)光譜全波段掃描圖

從圖9可以看出，經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖在280 nm處無(wú)蛋白質(zhì)吸收峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖已經(jīng)沒(méi)有蛋白質(zhì)，此時(shí)的蓮子多糖是一個(gè)純的蓮子多糖。這與陳嬋[6]的研究結(jié)果一致，陳嬋用DEAE-SephadexA-25分離蓮子多糖后得到一個(gè)組分，經(jīng)Sephrose CL-4B凝膠層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析得到蓮子多糖為純品。

4 結(jié)論

⑴采用蛋白酶酶解和sevag試劑處理后，得到蓮子多糖的酶法脫蛋白最佳工藝為：酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為50 min和木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL，在此工藝條件下，蛋白質(zhì)脫除率和多糖的損失率為74.25%和5.88%。經(jīng)sevag試劑處理2次后，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為85.5%，多糖損失率為7.5%。

⑵采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱對(duì)蓮子多糖進(jìn)行純化，純度鑒定采用紫外-可見(jiàn)光譜掃描法，結(jié)果表明，此分離純化的方法能得到單一組分蓮子多糖，該多糖組分均無(wú)蛋白質(zhì)和核酸的吸收峰，說(shuō)明該法能得到純度較高的多糖。