李瑜珍，鄭 琳，張惠媚，張春雷

(深圳市中醫(yī)院a.檢驗(yàn)科;b.中藥制劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518034)

銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，是引起醫(yī)院感染的主要病原菌，常引起呼吸道、傷口和燒傷患者創(chuàng)面感染［1］。其易定植，易產(chǎn)生多重耐藥性是臨床治療的難點(diǎn)。細(xì)菌感染后，菌體周圍環(huán)境會(huì)影響細(xì)菌存在的狀態(tài)［2］，有文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄糖、高滲氯化鈉會(huì)影響葡萄球菌在人工假體及生物材料上形成生物膜，也有文獻(xiàn)報(bào)道，鐵離子會(huì)影響細(xì)菌生物膜。為了解這些物質(zhì)對人體分離的銅綠假單胞菌生物膜的影響，為銅綠假單胞菌生物膜形成的預(yù)防和治療提供新的思路，同時(shí)為其體外生物膜模型的構(gòu)建提供實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件，本文收集15株銅綠假單胞菌，用結(jié)晶紫染色法檢測不同濃度的葡萄糖、氯化鈉及氯化鐵對其生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 15株銅綠假單胞菌分離自我院2017年1～9月住院患者，其中10株分離自痰標(biāo)本，2株分離自血液，3株分離自傷口分泌物，經(jīng)結(jié)晶紫染色法和銀染色法同時(shí)檢測，確認(rèn)都具有生物膜形成能力。

1.2 試劑和儀器 LB肉湯培養(yǎng)液由杭州濱和微生物試劑有限公司提供;葡萄糖、氯化鈉、氯化鐵、95%乙醇等化學(xué)試劑由汕頭市光華化學(xué)廠提供;結(jié)晶紫染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供;恒溫振蕩器由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 銅綠假單胞菌生物膜的制備:銅綠假單胞菌培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落于100 ml LB培養(yǎng)基在恒溫振蕩器35℃培養(yǎng)過夜;取1 ml培養(yǎng)過夜的菌液于100 ml LB培養(yǎng)液，35℃振蕩培養(yǎng)，用分光光度計(jì)檢測菌液濃度(波長595 nm)，待銅綠假單胞菌生長到了對數(shù)期，取適量菌液分別加入一定量的葡萄糖、氯化鈉及氯化鐵，使菌液中葡萄糖濃度分別為 0，27.75，55.51，83.26 和 111.01 mmol/L，氯化鈉濃度分別為 0，85.56，171.12，256.67 和342.23 mmol/L，氯化鐵濃度分別為 0，0.77，1.54，3.09和6.17 mmol/L。將各個(gè)濃度的菌液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μl，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，以LB液為空白對照，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用移液器小心吸干每孔菌液，PBS緩沖液洗滌3次去除浮游銅綠假單胞菌，生物膜即黏附在微孔中。

1.3.2 銅綠假單胞菌生物膜的檢測:生物膜用結(jié)晶紫染色，晾干，用無菌純水漂洗6次直至洗液無色，去除剩余結(jié)晶紫，每孔加入50 μl 95%(v/v)乙醇溶解生物膜上的染料后，將有色溶液在波長為570 nm處比色，讀取吸光度值(A570nm)。生物膜形成陽性株篩選標(biāo)準(zhǔn):菌株吸光度值(A570nm)均值與培養(yǎng)液空白吸光度值均值比值≥2，判定生物膜陽性菌株，比值的高低代表生物膜形成的多少。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用one way ANOVA單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葡萄糖對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響 見圖1。

圖1 不同濃度葡萄糖對銅綠假單胞菌生物膜的影響

葡萄糖濃度 27.75，55.51，86.23和 110.01 mmol/L組生物膜生成量與對照組比較，P值分別為 0.091，0.020，0.424 和 0.999，葡萄糖濃度55.51 mmol/L組與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)。

2.2 不同濃度氯化鈉對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響 見圖2。NaCl濃度85.56，171.12，256.67和342.23 mmol/L組生物膜生成量與對照組比較，P值分別為 0.036，0.017，0.242 和 0.212，NaCl濃度85.56 mmol/L及171.12 mmol/L組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036，0.017)，而這兩組之間比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.940)。

圖2 不同濃度氯化鈉對銅綠假單胞菌生物膜的影響

2.3 不同濃度氯化鐵對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響 見圖3。

圖3 不同濃度鐵離子對銅綠假單胞菌生物膜的影響

FeCl3濃度 0.77，1.54，3.09 和 6.17 mmol/L組生物膜生成量與對照組比較P=0.924，0.082，0.041，1.000，F(xiàn)eCl3濃度 3.09 mmol/L 組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。

3 討論細(xì)菌生物被膜導(dǎo)致許多臨床相關(guān)感染，有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌生物膜的形成與導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染有關(guān)，由致病細(xì)菌形成的細(xì)菌生物膜是人工關(guān)節(jié)感染的重要原因［3，4］。美國國立衛(wèi)生研究院的調(diào)查顯示，醫(yī)學(xué)上有超過80%以上的細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān)。細(xì)菌一旦形成生物膜，則能抵抗成百上千倍正常劑量的抗生素［5］，給臨床治療帶來極大困難，臨床應(yīng)該關(guān)注細(xì)菌生物膜形成的條件，預(yù)防生物膜生成。銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的常見病原菌，常引起難治性感染，臨床上許多醫(yī)學(xué)材料、器械的相互感染和某些頑固性感染性疾病的發(fā)生與其生物膜的形成有密切的關(guān)系［6］。本研究結(jié)果表明55.51 mmol/L的葡萄糖，85.56 mmol/L及171.12 mmol/L的氯化鈉，3.09 mmol/L的氯化鐵會(huì)促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜生成。正常人血糖濃度空腹為3.96～6.12 mmol/L，餐后最高也不會(huì)超過11.1 mmol/L，因此，血糖濃度不會(huì)影響非糖尿病患者感染的銅綠假單胞菌形成生物膜，只有嚴(yán)重的糖尿病患者血糖水平才有可能達(dá)到55.51 mmol/L，為此糖尿病患者如果感染銅綠假單胞菌，注意控制好血糖，防止其形成生物膜使治療變得困難。

氯化鈉在臨床醫(yī)療活動(dòng)中廣泛使用，輸液、清洗傷口，經(jīng)常會(huì)使用154 mmol/L氯化鈉，根據(jù)本研究結(jié)果，這個(gè)濃度的氯化鈉會(huì)促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的形成，因此，銅綠假單胞菌感染的患者，應(yīng)避免輸注氯化鈉溶液，對銅綠假單胞菌感染的傷口，應(yīng)盡量避免用氯化鈉溶液來沖洗。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，常規(guī)的154 mmol/L氯化鈉溶液只能從生物膜表面滑過，而無法破壞和清除生物膜，反而促進(jìn)其生物膜形成不利于治療。

鐵是人體的微量元素，在人體內(nèi)血清鐵的正常參考值男性為 10.6～36.7 μmol/L，女性為 7.8～32.2 μmol/L，根據(jù)本研究的結(jié)果，人體內(nèi)微量的鐵不會(huì)影響銅綠假單胞菌形成生物膜。鐵主要對外界環(huán)境的銅綠假單胞菌生物膜形成造成影響，據(jù)報(bào)道，鐵離子會(huì)促進(jìn)隱形眼鏡上銅綠假單胞菌形成生物膜造成眼角膜感染［7］。此外，銅綠假單胞菌廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境，也是使用中醫(yī)療器械主要的攜帶細(xì)菌［8］，復(fù)用醫(yī)療器械中生物膜的存在使得細(xì)菌可抵抗清洗與消毒的作用，造成生物材料清洗和消毒的失敗，生物膜中的細(xì)菌可以從醫(yī)療器械表面不斷脫落，經(jīng)血液循環(huán)引起急、慢性感染［9］。為此不銹鋼材質(zhì)的復(fù)用醫(yī)療器械要注意做好防銹工作，防止銅綠假單胞菌在其表面形成生物膜導(dǎo)致難以清除造成醫(yī)院感染。研究這三種物質(zhì)對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響具有重要的臨床意義，一方面對已發(fā)生的感染可通過控制血糖濃度，減少氯化鈉的輸入，對銅綠假單胞菌感染的傷口，避免用生理鹽水沖洗，不銹鋼材質(zhì)的復(fù)用醫(yī)療器械要注意做好防銹工作，預(yù)防細(xì)菌生物膜的形成;另一方面，銅綠假單胞菌的生物膜感染是目前臨床研究的熱點(diǎn)，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，經(jīng)常需要在體外構(gòu)建其生物膜模型，根據(jù)本研究的結(jié)果，在體外構(gòu)建銅綠假單胞菌生物膜模型時(shí)，可加入適量的葡萄糖、氯化鈉或氯化鐵以促進(jìn)其生物膜形成，為進(jìn)一步研究其形成機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件。