高正琴 (中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

真菌疾病威脅著人類和動(dòng)物的健康。在全球范圍內(nèi)，每年至少有1150萬(wàn)人死于危及生命的侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)(http://www.gaffi.org/)［1］。犬被廣泛用于生物化學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等的研究中。犬群體飼養(yǎng)，容易感染真菌引發(fā)疾病，特別是人獸共患真菌病，會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還會(huì)對(duì)飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員造成健康危害。因此，全面了解犬真菌種類和致病性真菌的分布，做好真菌監(jiān)測(cè)分析工作具有重要意義。分離培養(yǎng)與鑒定是研究犬真菌的基礎(chǔ)，隨著科技的進(jìn)步和研究方法的不斷改進(jìn)，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的多種技術(shù)在各領(lǐng)域中得到大量應(yīng)用，通過(guò)形態(tài)學(xué)與分子手段相配合的方式成為對(duì)真菌的分類地位加以確定的重要方法。本研究聯(lián)合應(yīng)用真菌培養(yǎng)、PCR，基因克隆和測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行犬真菌種類、數(shù)量及分布情況調(diào)查，為致病性真菌感染、真菌毒素引起的疾病的防治提供有益的參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 55只犬來(lái)自北京地區(qū)幾個(gè)不同廠家，編號(hào)1011E1～1011E55，活體采集毛發(fā)皮屑和直腸拭子［2］。

1.2 試劑和儀器 真菌培養(yǎng)基、鑒定試劑和抗真菌藥敏片分別購(gòu)自英國(guó)OXOID公司和丹麥ROSCO公司。DNA提取和PCR擴(kuò)增回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司。生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國(guó));Verity 96 Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystyem，美國(guó));Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)(東樂(lè)自然基因生命科學(xué)公司)。

1.3 方法

1.3.1 真菌分離培養(yǎng)鑒定:在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，將采集的樣本做特定處理后分別接種沙保氏葡萄糖瓊脂斜面、改良馬丁瓊脂斜面、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板，分別置28℃和35℃培養(yǎng)3～14天。將分離獲得的真菌菌株，劃線接種改良馬丁瓊脂平板、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板，分別置28℃和35℃培養(yǎng)3～14天。挑取單菌落，接種改良馬丁瓊脂斜面、改良馬丁瓊脂平板、皮膚病原真菌鑒別瓊脂平板、改良馬丁液體培養(yǎng)基，分別置28℃和35℃培養(yǎng)3～14天。通過(guò)觀察真菌分離株的生長(zhǎng)速度、菌落直徑、質(zhì)地、顏色、形態(tài)、氣味、菌落反面和可溶性色素、培養(yǎng)基中滲出物的有無(wú)等進(jìn)行大體分類。對(duì)每一類典型的菌落進(jìn)行鏡檢，觀察菌絲和分生孢子形態(tài)特征、孢子著生部位及排列方式等，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄存檔。參照各種真菌形態(tài)描述及檢索表，進(jìn)行真菌菌種的初步鑒定和分類［3～5］。對(duì)形態(tài)學(xué)特征不能鑒定到種的真菌結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定和分類。

1.3.2 DNA提取:使用通用型基因組DNA試劑盒提取真菌DNA。

1.3.3 引物設(shè)計(jì):參考文獻(xiàn)［6～9］，采用真菌核糖體DNA(nuclear ribosomal DNA，rDNA)標(biāo)記進(jìn)行真菌分類鑒定，針對(duì)真菌核糖體RNA基因(ribosomal RNA gene，rRNA) 小亞基 (small subunit，SSU，18S)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS，ITS1+5.8S+ITS2)、大亞基(large subunit，LSU，25～28S)區(qū)域設(shè)計(jì)普通PCR檢測(cè)引物，見(jiàn)表1。

表1 真菌PCR引物序列

1.3.4 PCR體系:PCR總反應(yīng)體系為50 μl，包括10×Buffer(Mg2+Plus)5.0 μl，dNTP Mixture 4.0 μl，正反向引物各 0.5 μl，EX Taq 0.25 μl，模板DNA 3 μl，nuclease-free water 36.75 μl。循環(huán)參數(shù):94℃ 5 min 1 個(gè)循環(huán);94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃5 min 1個(gè)循環(huán)。

1.3.5 基因克隆測(cè)序鑒定:取真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳?；厥占兓康臈l帶，進(jìn)行基因克隆測(cè)序鑒定。將所獲得的犬真菌基因測(cè)序數(shù)據(jù)，在線提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)，通過(guò) BLAST(Basic Alignment Search Tool)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行比對(duì)分析，確定真菌種屬。

1.3.6 藥敏分析:根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(national committee for clinical laboratory standard，NCCLS)的規(guī)定，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，白色念珠菌ATCC 64548作為試驗(yàn)質(zhì)控株［10～12］。將待測(cè)真菌在沙保氏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種，以保證其純度和活性。采用丹麥ROSCO公司的Neo-Sensitab抗真菌藥敏片:制霉菌素(nystatin，NYST;50 μg)、兩性霉素 B(amphotericin B，AMPHO;10 μg)、氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LZ;25 μg)、益康唑(econazole，ECONZ;10 μg)、沃爾康唑(voriconazole，VOR;1 μg)、咪康唑(miconazole，MICO;10 μg)、酮康唑(ketoconazole，KETO;15 μg)、克霉唑(clotrimazole，CLOTRI;10 μg)、氟胞嘧啶(fluorocytosine，F(xiàn)LU;10 μg)、特比萘芬(terbinafine，TEB;30 μg)。在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，配制0.5麥?zhǔn)蠁挝徽婢鷳乙海蒙睇}水作1∶1稀釋，使接種液濃度為5×105CFU(colony-forming unit，菌落形成單位)/ml。用移液管吸取0.5 ml接種液，傾注于改良SHADOMY瓊脂平板表面，涂布均勻。用無(wú)菌眼科鑷將含有定量抗真菌藥物的藥片貼在已接種待檢真菌的瓊脂平板表面，并用鑷尖輕壓一下藥片，使其貼平。每個(gè)藥片的間距不小于24 mm，藥片的中心距平板的邊緣不小于15 mm，90 mm直徑的平板適宜貼6個(gè)藥片。將貼好藥片的平板置35℃培養(yǎng)18～24 h后，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。藥片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會(huì)不斷地向藥片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度，在藥片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢真菌的生長(zhǎng)被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映檢測(cè)真菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度。根據(jù)抑菌圈的大小(不同抗真菌藥物其抑菌圈大小的標(biāo)準(zhǔn)不一致)，判斷為敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistant，R)。試驗(yàn)用抗真菌藥物結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下:制霉菌素(50 μg)抑菌圈直徑≥15 mm，判為敏感;抑菌圈直徑在10 mm～14 mm之間，判為中介度;無(wú)抑菌圈，判為耐藥;兩性霉素B(10 μg)≥15 mm，S;10～14 mm，I;＜10 mm，R;氟康唑(25 μg)≥20 mm，S;12～19 mm，I;≤11 mm，R;益康唑(10 μg)≥20 mm，S;12～19 mm，I;≤11 mm，R;沃爾康唑(1 μg)≥14 mm，S;咪康唑(10 μg)≥20 mm，S;12～19 mm，I;≤11 mm，R;酮康唑(15 μg)≥30 mm，S;23～29 mm，I;≤22 mm，R;克霉唑(10 μg)≥20 mm，S;12～19 mm，I;≤11 mm，R;氟胞嘧啶(10 μg)≥30 mm，S;23～29 mm，I;≤22 mm，R;特比萘芬(30 μg)≥20 mm，S;12～19 mm，I;≤11 mm，R。

2 結(jié)果

2.1 真菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果 本研究利用真菌培養(yǎng)法從中國(guó)北京地區(qū)55只犬中分離獲得存活真菌29株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為:黃曲霉(Aspergillus flavus)2株(1011-E33，1011-E34)、雜色曲霉(Aspergillus versicolor)2株(1011-E2，1011-E50)、日本曲霉(Aspergillus japonicas)1株(1011-E53)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)2 株(1011-E31、1011-E32)、總狀毛霉(Mucor racemosus)2株(1011-E41，1011-E45-2)、多變根毛霉(Rhizomucor variabilis)1株(1011-E42)、殼青霉(Penicillium crustosum)1株(1011-E45-1)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)1株(1011-E51)、厚皮馬拉塞霉菌(Malassezia pachydermatis)1株(1011-E27)、球毛殼霉(Chaetomium globosum)2株(1011-E3，1011-E4)、黃色蠕形霉(Talaromyces flavus)1株(1011-E43)、多喙莖點(diǎn)霉(Phoma multirostrata)1株(1011-E25)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)1株(1011-E52)、枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)1株(1011-E14)、尖孢枝孢(Cladosporium oxysporum)1株(1011-E28)、極細(xì)枝孢霉(Cladosporium oxysporum)1株(1011-E29)、類星形毛孢子菌(Trichosporon asteroids)1株(1011-E6)、阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii)1株(1011-E55)、光滑念珠菌(Candida glabrata)4 株(1011-E44-2，1011-E46，1011-E48，1011-E49)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)1株(1011-E35)和東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)1株(1011-E44-1)。獲得的29株經(jīng)純化轉(zhuǎn)種存活的真菌中有8株分離自犬直腸樣本27.6%(8/29)，21株分離自毛發(fā)皮屑樣本72.4%(21/29)。犬直腸部位優(yōu)勢(shì)真菌(advantage fungi genera)主要為毛孢子菌屬和酵母屬真菌，毛發(fā)皮膚處優(yōu)勢(shì)真菌主要為曲霉菌屬、毛霉菌屬和枝孢菌屬真菌。圖1顯示的是部分真菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)和菌絲孢子的典型特征:雜色曲霉(A，B)、日本曲霉(C，D)、黃曲霉(E，F(xiàn))、黃色蠕形霉(G，H)、球毛殼霉(I，J)、厚皮馬拉塞霉菌(K，L)、卷枝毛霉(M，N)、總狀毛霉(O，P)、枝狀枝孢菌(Q，R)、尖孢枝孢(S，T)、尖孢鐮刀菌(U，V)、光滑念珠菌(W，X)。

圖1 犬真菌培養(yǎng)特性和形態(tài)照片

2.2 真菌PCR、基因克隆及測(cè)序鑒定 采用真菌PCR檢測(cè)犬真菌，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取電泳條帶單一、明亮的PCR產(chǎn)物，回收純化后進(jìn)行基因克隆、序列測(cè)定。將測(cè)得的基因序列采用Blast程序與GenBank中已公布的相關(guān)真菌的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，找出最相近的序列信息，確定大致分類地位。當(dāng)序列相似性＞99%時(shí)，真菌菌株被鑒定到種的水平;相似性＜99%時(shí)，鑒定到屬的水平;而相似性＜95%時(shí)，則不能被鑒定。部分生長(zhǎng)不良及形態(tài)特征難以分辨的真菌菌株結(jié)合真菌基因克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析核實(shí)。表2結(jié)果顯示:獲得的29株犬真菌分離菌株核糖體基因序列與GenBank中序列核苷酸同源性為99%～100%。本研究發(fā)現(xiàn)犬真菌分布于12屬21種，其中:念珠菌屬(Candida)1種(光滑念珠菌4株)、酵母屬2種(庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母1株、東方伊薩酵母1株)、毛孢子菌屬(Trichosporon)2種(阿薩希毛孢子菌1株、類星形毛孢子菌1株)、曲霉屬(Aspergillus)3種(黃曲霉2株、雜色曲霉2株、日本曲霉1株)、毛霉菌屬(Mucor)3種(卷枝毛霉2株、總狀毛霉2株、多變根毛霉1株)、青霉菌屬(Penicillium)2種(殼青霉1株、產(chǎn)黃青霉1株)、毛殼屬(Chaetomium)1種(球毛殼霉2株)、馬拉塞霉屬(Malassezia)1種(厚皮馬拉塞霉菌1株)、藍(lán)狀菌屬(Talaromyces)1種(黃色蠕形霉1株)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)(多喙莖點(diǎn)霉1株)、鐮刀菌屬(Fusarium)1種(尖孢鐮刀菌1株)、枝孢菌屬(Cladosporium)3種(枝狀枝孢菌1株、尖孢枝孢1株、極細(xì)枝孢霉1株)。分子鑒定結(jié)果表明，犬真菌多樣性比較豐富，曲霉屬、毛霉屬、枝孢菌屬真菌在這些致病真菌中占主導(dǎo)地位。

表2 犬真菌測(cè)序分析

2.3 藥敏分析結(jié)果 部分真菌抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。類星形毛孢子菌(1011-E6)、厚皮馬拉塞霉菌(1011-E27)、卷枝毛霉(1011-E31)、黃曲霉(1011-E33，1011-E34)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(1011-E35)、多變根毛霉(1011-E42)、黃色蠕形霉(1011-E43)、阿薩希毛孢子菌(1011-E55)，結(jié)果顯示，這些真菌對(duì)制霉菌素、咪康唑、沃爾康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶等抗真菌藥物已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。

表3 犬真菌藥敏試驗(yàn)

3 討論目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)犬真菌監(jiān)測(cè)分析的報(bào)道，犬致病性真菌的研究信息更少。因此，本研究調(diào)查分析了犬?dāng)y帶的真菌，識(shí)別了致病性真菌，填補(bǔ)了這一研究空白。本次調(diào)查中，犬真菌總的感染率(至少檢出一種真菌的百分比)為52.7%(29/55)。共發(fā)現(xiàn)了12屬21種不同的真菌，其中:曲霉屬、毛霉屬、枝孢菌屬出現(xiàn)頻率較高，為優(yōu)勢(shì)屬，它們大多為人獸共患病病原體［13～15］。犬曲霉屬、毛霉屬、枝孢菌屬感染率很高(分別為9.09%，9.09%和5.45%)，主要為黃曲霉、雜色曲霉、日本曲霉、卷枝毛霉、總狀毛霉、多變根毛霉、枝狀枝孢菌、尖孢枝孢和極細(xì)枝孢霉。黃曲霉毒素的靶器官是肝臟，產(chǎn)生肝細(xì)胞毒和免疫抑制［16］。雜色曲霉導(dǎo)致犬播散性感染的致死罕見(jiàn)病例表現(xiàn)為脊椎炎、骨髓炎和腎盂腎炎［17］。多變根毛霉感染引起毛霉病，造成局部皮膚黏膜嚴(yán)重破壞，可深達(dá)骨組織，病程漫長(zhǎng)可達(dá)十余年［18］。本研究犬光滑念珠菌感染率較高(7.27%)，光滑念珠菌是人類最常見(jiàn)的致病真菌之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的復(fù)發(fā)性念珠菌?。?9］。本研究犬毛孢子菌感染率為3.63%。毛孢子菌是人類的新機(jī)會(huì)性病原體。在免疫功能低下的患者中，阿薩希毛孢子菌和類星形毛孢子菌是引起播散性疾病的最重要的物種，而對(duì)阿薩希毛孢子菌的吸入是健康個(gè)體中夏季型高敏性肺炎的最重要原因［20］。球毛殼霉可引起甲真菌?。?1］。厚皮馬拉塞霉菌感染犬可引起皮炎、中耳炎，對(duì)人類早產(chǎn)兒和免疫缺陷成年人易導(dǎo)致系統(tǒng)性血源性感染［22］。尖孢鐮刀菌導(dǎo)致癌癥兒童導(dǎo)管相關(guān)感染［23］。

診斷侵襲性真菌感染的最高確定性是由活檢或針吸活檢的組織中存在的真菌確定［24］。傳統(tǒng)的真菌鑒定主要是以形態(tài)學(xué)為根據(jù)，而形態(tài)特征受營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和溫、濕、光、時(shí)間、pH等條件的影響，易發(fā)生變異(形態(tài)、菌落、色素、毒力)，有些真菌因環(huán)境條件改變，可由一種形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形態(tài)，難以準(zhǔn)確鑒定到種。僅從形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分阿薩希毛孢子菌與類星形毛孢子菌，而雜色曲霉、日本曲霉等在真菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，本研究通過(guò)提取這些真菌DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、基因克隆、測(cè)序鑒定，經(jīng)在線序列比對(duì)分析，能夠快速準(zhǔn)確將真菌區(qū)分為屬和種，提示形態(tài)學(xué)方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)相互補(bǔ)充，可簡(jiǎn)單快速精準(zhǔn)做好真菌物種的鑒定。本研究真菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，這些真菌已經(jīng)對(duì)制霉菌素、咪康唑、沃爾康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶等抗真菌藥物產(chǎn)生了耐藥性。由此可見(jiàn)，及時(shí)進(jìn)行真菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，及早明確病原學(xué)診斷和對(duì)抗真菌藥物的敏感性，正確選用抗真菌藥物是防制致病性真菌感染成功的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究聯(lián)合應(yīng)用真菌培養(yǎng)、PCR，基因克隆和測(cè)序技術(shù)，以形態(tài)學(xué)特征為基本分類依據(jù)，通過(guò)靶基因序列測(cè)定、比較和分析，準(zhǔn)確鑒定犬真菌，研究犬真菌多樣性豐富性，獲得了較為全面的結(jié)果，充實(shí)了犬真菌種子庫(kù)。通過(guò)對(duì)真菌rDNA進(jìn)行分析，為純/混合培養(yǎng)、復(fù)合樣本中在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上很難分離的毛孢子菌屬、曲霉屬真菌的區(qū)分提供了一種簡(jiǎn)便快速工具。今后，我們還將進(jìn)一步應(yīng)用宏基因組和高通量測(cè)序分析技術(shù)，對(duì)犬中可能存在但用現(xiàn)行培養(yǎng)方法無(wú)法獲得的真菌(主要為深部真菌)展開(kāi)深入調(diào)查研究，獲得更多更全面的關(guān)于犬真菌多樣性的數(shù)據(jù)，為真菌致病性研究和相關(guān)疫病防制提供科學(xué)參考依據(jù)。