谷鈺峰，李 昱，張曉錄，黃葆華，孫成銘 (煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗(yàn)中心，山東煙臺 264000)

血流感染(blood stream infection，BSI)是導(dǎo)致重癥疾患病人死亡的最常見原因之一［1］，早期、針對性的抗生素治療可明顯提高此類患者的生存率。血培養(yǎng)目前仍然是診斷臨床血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法從培養(yǎng)到鑒定至少需要18～48 h，若再進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，則報(bào)告的總耗時(shí)可能長達(dá)36～72 h［2］。因此，改進(jìn)方法，縮短微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間是傳統(tǒng)微生物學(xué)檢驗(yàn)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。

近年來，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)、流式細(xì)胞學(xué)(FCM)以及高通量測序等技術(shù)在臨床微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用中得到了迅猛的發(fā)展，其中以MALDI-TOF-MS的運(yùn)用最為廣泛［3］?；诓煌?xì)菌間存在特異性蛋白質(zhì)譜峰差異的原理，通過MALDI-TOF MS技術(shù)，可以在1 h內(nèi)完成對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中高純度病原菌的鑒定［4］。

由于目前的數(shù)據(jù)庫中尚缺乏耐藥性相關(guān)蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因此病原體的藥敏試驗(yàn)仍依靠傳統(tǒng)的紙片擴(kuò)散法或稀釋法來完成。由于其原理是基于微生物的代謝反應(yīng)，細(xì)菌培養(yǎng)的較長耗時(shí)仍是不可避免的，因此尚不能滿足快速藥敏試驗(yàn)的要求［5］。隨著流式細(xì)胞學(xué)(FCM)靈敏度的不斷提高，其應(yīng)用面已從最初的真核細(xì)胞免疫表型分析擴(kuò)展到對原核生物甚至病毒的檢測。FCM以其快速、靈敏、多參數(shù)等特點(diǎn)，不僅可以將臨床藥敏的報(bào)告時(shí)間縮短至3 h以內(nèi)，而且可對與臨床預(yù)后緊密相關(guān)的病原菌耐藥的異質(zhì)性進(jìn)行檢測［6］。

本研究的目的是通過將MALDI-TOF-MS與FCM聯(lián)合應(yīng)用，以創(chuàng)新性的菌體純化系統(tǒng)為基礎(chǔ)開發(fā)一套臨床血流感染快速診斷的新方法，以達(dá)到將病原菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間控制在3 h以內(nèi)的目的。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及菌株來源 本研究中所有血培養(yǎng)標(biāo)本均來自煙臺毓璜頂醫(yī)院微生物檢驗(yàn)科，共收集到血培養(yǎng)陽性標(biāo)本238例。當(dāng)血培養(yǎng)儀提示標(biāo)本培養(yǎng)陽性時(shí)立即將其取出，進(jìn)行革蘭染色以及常規(guī)培養(yǎng)和鑒定程序，并按革蘭染色結(jié)果將標(biāo)本分為革蘭陽性菌組、革蘭陰性菌組以及真菌組。本研究選擇了臨床常用的抗生素敏感試驗(yàn)明確的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株，其中包括:糞腸球菌(E.faecalis，ATCC 29212)、金黃色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)、大腸埃希菌(E.coli，ATCC 35218)、銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa，ATCC 27853)以及大腸埃希菌(E-.coli，ATCC 25922)和本室保存的白假絲酵母菌臨床分離株。

1.2 儀器和試劑 流式細(xì)胞儀為美國BD公司CantooII型;MALDI-TOF質(zhì)譜儀購自美國 Bruker Daltonik公司;全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司VITEK2型。所使用的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品來自北京中國藥品生物制品檢定所;碘化丙啶(PI)及細(xì)胞活性染料熒光素二乙酸酯(FDA)等均購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn):當(dāng)血培養(yǎng)儀提示有陽性出現(xiàn)時(shí)，將陽性瓶取出后進(jìn)行革蘭染色以判斷病原體的染色性，取適量標(biāo)本接種于血平板和麥康凱平板上進(jìn)行培養(yǎng)并采用VITEK2系統(tǒng)及相應(yīng)的鑒定卡對病原菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.3.2 直接分離膠-吸附法純化法分離血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的菌體:用無菌注射器取5 ml陽性血培養(yǎng)物于無菌凝膠分離管中1000 r/min室溫離心5 min;吸取上層液體置于吸附柱內(nèi)，1000 r/min室溫離心5 min后將離心管內(nèi)液體棄去;無菌去離子水洗滌兩次后向?yàn)V膜上加入100 μl無菌水，混勻后備用。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定和判定標(biāo)準(zhǔn):用無菌微量吸頭取5μl菌液，滴加于靶板上，自然干燥后覆蓋70%的甲酸溶液 5 μl，干燥后再加 5 μl基質(zhì)液，待再次干燥后即可上機(jī)檢測。使用配套軟件采集并對質(zhì)譜峰圖進(jìn)行分析，根據(jù)制造商提供的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，將得分＜1.7視為鑒定不可靠(NRI);得分介于1.7～2.0的鑒定可以確認(rèn)到屬;得分＞2.0者為極好的鑒定，結(jié)果可明確到種。若鑒定得分＞1.7時(shí)，通過軟件提供的微生物列表我們選取第一個(gè)微生物作為鑒定結(jié)果。

1.3.4 流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn):取純化后的菌液50 μl，接種于2 ml LB 培養(yǎng)液內(nèi)，37℃震蕩增菌培養(yǎng)1 h。分別取200 μl增菌培養(yǎng)物置于含有不同抗生素(表1)的LB培養(yǎng)液內(nèi)。37℃震蕩培養(yǎng)2 h后離心。將上清液棄去后，向沉淀中加入PI和FDA染料各4 μl，避光孵育15 min，加入 PBS溶液0.3 ml上機(jī)檢測。抗生素濃度及折點(diǎn)判讀以CLSI 2016版為參考。

表1 流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn)所涉及到的抗生素及濃度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件完成，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的革蘭染色分組 本研究中共收集到血培養(yǎng)陽性標(biāo)本238例，經(jīng)革蘭染色后進(jìn)行分組。其中，革蘭陽性組76例，均為陽性球菌;革蘭陰性組134例，為革蘭陰性桿菌;真菌組28例。

2.2 MALDI-TOF MS和VITEK2鑒定結(jié)果 見表2。本研究分別采用了 MALDI-TOF MS法和VITEK2鑒定系統(tǒng)兩種方法對所分離的238株病原體進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，整體上MALDI-TOF MS法與VITEK2二者的鑒定結(jié)果基本相符。238株病原菌的鑒定結(jié)果如下:革蘭陰性桿菌134株:其中大腸埃希菌32株、肺炎克雷伯菌30株、銅綠假單胞菌21株、產(chǎn)氣腸桿菌13株、鮑曼不動(dòng)桿菌10株、產(chǎn)酸克雷伯桿菌8株、奇異變形桿菌5株、陰溝腸桿菌3株、弗勞地枸椽酸桿菌3株、其他菌9株;革蘭陽性球菌76株:其中金黃色葡萄球菌18株、溶血葡萄球菌11株、人葡萄球菌9株、糞腸球菌9株、表皮葡萄球菌8株、模仿葡萄球菌8株、屎腸球菌6株、其他7株;真菌28株:其中白色念珠菌11株、熱帶念珠菌7株、光滑念珠菌3株、近平滑念珠菌2株、葡萄牙念珠菌1株、克柔念珠菌1株、菌膜念珠菌1株、解脂念珠菌1株、產(chǎn)朊念珠菌1株。對常見細(xì)菌而言，兩種方法的種鑒定準(zhǔn)確率均大于90%。對真菌組，MALDI-TOF-MS法可將75%(21/28)的菌株鑒定到種，VITEK2僅有60%(17/28);在對真菌的鑒定中，VITEK2出現(xiàn)了14%(4/28)的無法鑒定株，而 MALDI-TOF MS的未鑒定率為3%。

表2 MALDI-TOF-MS法和VITEK2鑒定系統(tǒng)對238株病原菌的鑒定情況

2.3 流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn)結(jié)果 本研究采用流式細(xì)胞學(xué)直接藥敏試驗(yàn)法對分離到的238株臨床病原菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)CM法的快速藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 VITEK2法的結(jié)果無明顯差異(t=4.30，P=0.127)，見表3。部分菌株的流式檢測結(jié)果見圖1。

表3 FCM法和VITEK2系統(tǒng)對238株病原菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的對比

圖1 部分菌株的流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn)結(jié)果

革蘭陰性菌中有94.7%(127/134)的菌株對氨芐西林耐藥，53.7%(72/134)的菌株為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株。部分耐藥菌株的流式細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果見圖2。通過與VITEK2系統(tǒng)的藥敏結(jié)果進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)果完全一致。

圖2 部分產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的流式細(xì)胞學(xué)藥敏鑒定結(jié)果

本研究中通過細(xì)胞活性染料FDA的加入，我們在5例患者的感染菌群中發(fā)現(xiàn)了明顯的抗生素敏感異質(zhì)性，見圖3。

圖3 部分菌株的抗生素敏感異質(zhì)性流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果

3 討論MALDI-TOF MS技術(shù)的出現(xiàn)為細(xì)菌的快速鑒定提供了可靠、高效、廉價(jià)的新方法［7］。由于質(zhì)譜技術(shù)對蛋白的豐度和純度都有較高的要求，因此需要先對培養(yǎng)物中的菌體進(jìn)行分離，以去除其中的細(xì)胞及血漿蛋白對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾［8］。本課題先通過分離膠將培養(yǎng)物的細(xì)胞組分去除，再將富含菌體的血漿通過吸附膜吸附，最后用去離子無菌水進(jìn)行洗滌。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在一只離心管中進(jìn)行，且不引入其他裂解劑。通過富集5ml培養(yǎng)物，所得菌體不僅可以滿足質(zhì)譜鑒定的需求，還可以進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)快速藥敏試驗(yàn)。與目前常見的菌體分離方法如差速離心法、活性劑裂解法和商品化試劑盒等相比，本方法具有省時(shí)、高效，不攜帶裂解劑污染等優(yōu)點(diǎn)，且廢棄物可方便處理、整體成本較低，非常適用于快速診斷。

在本研究中，我們采用MALDI-TOF MS技術(shù)對所純化的238株病原菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)鑒定方法相比，二者對常見菌均有大于90%的鑒定到種的能力。MALDI-TOF MS可將75%的真菌菌株鑒定到種而VITEK2僅有60%;且在對真菌的鑒定中，VITEK2出現(xiàn)了14%(4/28)的無法鑒定株，而MALDI-TOF MS的未鑒定率為3%。這表明MALDI-TOF MS可以很好地對各種常見病原體進(jìn)行鑒定，這與相關(guān)報(bào)道的結(jié)論一致。

流式細(xì)胞學(xué)(FCM)可通過對微生物的代謝參數(shù)如膜的完整性、光散射特性及酶活性的檢測從而反映微生物對抗生素的敏感性［9］。該技術(shù)不僅具有高效、快速、多參數(shù)等特點(diǎn)。本研究通過流式細(xì)胞學(xué)對分離到的238株臨床病原菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明與VITEK2系統(tǒng)的藥敏結(jié)果幾乎完全一致。二者結(jié)果間微小差異的產(chǎn)生可能是由于方法學(xué)的差異所造成的，此外，細(xì)胞活性染料FDA的加入可以很好地發(fā)現(xiàn)感染菌群中的耐藥異質(zhì)性，這對于臨床具有重要價(jià)值。通過FDA的檢測結(jié)果不僅可以早期對患者體內(nèi)病原體的耐藥性變化進(jìn)行檢測，而且還可以提示臨床醫(yī)師進(jìn)一步優(yōu)化抗生素的使用方案［10］。即使是某些MALDI-TOF MS不能得出可靠鑒定結(jié)果的罕見微生物的感染，在經(jīng)過革蘭染色后，我們?nèi)匀豢梢圆捎昧魇郊?xì)胞學(xué)對病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并將結(jié)果及時(shí)告知臨床，為臨床醫(yī)生爭取寶貴的用藥時(shí)間［11］。

本研究將MALDI-TOF MS和FCM技術(shù)相結(jié)合，不僅可應(yīng)用于血流感染的快速鑒定和藥敏分析，更適用于對無菌體液的分析。采用本研究方法，可將微生物報(bào)告時(shí)間從傳統(tǒng)的36～72 h縮短至3 h以內(nèi)。本研究尚存一定的局限性，比如在FCM法快速藥敏試驗(yàn)中，我們涉及的抗生素并不全面，因此還需要進(jìn)一步探索。