許耘，田佳鑫，楊曉冬，鄧潔

（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京，100081）

近年來，隨著人類輔助生殖技術(shù)（ART）的不斷成熟，輔助生殖技術(shù)用相關(guān)醫(yī)療器械產(chǎn)品也逐漸增多，出現(xiàn)了諸如穿刺取卵針、顯微注射針、胚胎移植導(dǎo)管、培養(yǎng)皿等耗材類醫(yī)療產(chǎn)品。由于輔助生殖用醫(yī)療耗材的作用對(duì)象是配子、合子及不同細(xì)胞階段的胚胎，這些細(xì)胞對(duì)微環(huán)境的變化十分敏感，ART過程中微小的環(huán)境因素都會(huì)對(duì)胚胎的生理學(xué)、遺傳學(xué)產(chǎn)生影響。有研究表明，甲醛殘留、葡萄糖含量、血清濃度等均有可能影響卵裂率[1]，影響DNA甲基化及基因印記過程，從而使子代出現(xiàn)印記異常并可能導(dǎo)致出生缺陷的發(fā)生[2]。這些因素對(duì)未來個(gè)體發(fā)育影響深遠(yuǎn)、作用難以磨滅。

正是因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞的敏感性和分化潛能，歐洲替代方法驗(yàn)證中心（the European Center for the Validation of AlternativeMethods, ECVAM）提出的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)（embryonic stem cell test, EST）作為體外篩選和評(píng)價(jià)受試物發(fā)育毒性的手段已為學(xué)術(shù)界普遍接受[3]。在EST的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)受試物質(zhì)毒性的評(píng)價(jià)和檢測(cè)終點(diǎn)不應(yīng)僅僅考慮細(xì)胞毒性，還應(yīng)考慮胚胎毒性。原因在于有些受試物在低濃度時(shí)即可抑制干細(xì)胞分化, 具有較強(qiáng)的胚胎毒性；而其細(xì)胞毒性作用濃度（包括成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用濃度）卻比胚胎毒性濃度高出很多個(gè)數(shù)量級(jí)[4]。

鑒于此，在對(duì)輔助生殖用耗材醫(yī)療產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)設(shè)計(jì)和技術(shù)審評(píng)時(shí)，相關(guān)的生物學(xué)評(píng)價(jià)項(xiàng)目及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及生產(chǎn)工藝過程中各種化學(xué)物質(zhì)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本文綜述環(huán)氧乙烷滅菌殘留量對(duì)胚胎細(xì)胞的影響并探討如何合理制定輔助生殖用耗材類醫(yī)療器械產(chǎn)品中環(huán)氧乙烷殘留限量的要求。

1 環(huán)氧乙烷的毒理作用機(jī)制

環(huán)氧乙烷（ethylene oxide，EO）是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的雜環(huán)氧化物滅菌劑。環(huán)氧乙環(huán)在低溫下為無色液體，沸點(diǎn)10.8℃，在常溫下為無色氣體，易燃、易爆、空氣中濃度達(dá)3%以上，即有爆炸危險(xiǎn)。環(huán)氧乙烷的殺菌原理是通過對(duì)微生物蛋白質(zhì)分子的烷基化作用，干擾酶的正常代謝而使微生物死亡。其主要優(yōu)點(diǎn)是穿透力強(qiáng)、殺菌譜廣，對(duì)材料破壞力小。因此，環(huán)氧乙烷滅菌是醫(yī)療器械產(chǎn)品常用的低溫滅菌方法。然而作為化學(xué)滅菌劑，環(huán)氧乙烷對(duì)于人體也是致癌和致畸化學(xué)物質(zhì)。關(guān)于環(huán)氧乙烷的毒性及其在醫(yī)療器械產(chǎn)品中殘留量的研究一直受到關(guān)注。

在動(dòng)物致癌研究中，吸入環(huán)氧乙烷可導(dǎo)致包括白血病、腦腫瘤和乳腺腫瘤，而食入或皮下注射環(huán)氧乙烷會(huì)在接觸部位形成腫瘤。1994年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）依據(jù)環(huán)氧乙烷的作用機(jī)理，重新將其劃分為人類致癌物質(zhì)（一類）。此外，環(huán)氧乙烷還可與生產(chǎn)環(huán)境中的氯離子反應(yīng)，生成2－氯乙醇（ECH），ECH具有輕微的致突變性，具有產(chǎn)生胎兒毒性和致畸性改變的潛能，并對(duì)肺、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有損傷[5]。

環(huán)氧乙烷的毒理作用機(jī)制在于它具有很強(qiáng)的親電子性, 易與核酸和蛋白質(zhì)分子的親核中心反應(yīng)。環(huán)氧乙烷對(duì)DNA堿基的烷化作用被認(rèn)為是其一系列基因毒性的分子基礎(chǔ)。理論分析、離體模擬反應(yīng)以及分離的體內(nèi)烷化DNA分析結(jié)果都說明EO并非與DNA鏈上不同親核中心隨機(jī)發(fā)生烷化反應(yīng)的，而是優(yōu)先與DNA鏈上鳥嘌呤的N7位反應(yīng), 生成N 7-(2-羥乙基)-鳥嘌呤加合物，該加合物可占EO與離體DNA 反應(yīng)產(chǎn)物總量的90 %。EO也會(huì)與蛋白質(zhì)肽鏈上的親核中心發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)可能發(fā)生在半胱氨酸的巰基，組氨酸咪唑環(huán)Nl位、N3 位氮原子以及肽鏈末端纈氨酸。EO-血紅蛋白加合物的生成水平顯著高于相應(yīng)的DNA加合物生成水平[6]。

2 環(huán)氧乙烷對(duì)生殖細(xì)胞的影響

環(huán)氧乙烷對(duì)生殖細(xì)胞影響的研究起步很早, 研究對(duì)象從細(xì)菌、嚙齒類、靈長(zhǎng)類直至人類都有涉及,作用水平包括整體水平、組織器官水平、細(xì)胞染色體水平以及DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子水平。

中國(guó)科學(xué)院上海昆蟲研究以黑腹果蠅為材料，檢測(cè)吸入環(huán)氧乙烷對(duì)不同發(fā)育階段的果蠅生殖細(xì)胞，包括成熟精子、精細(xì)胞和精母細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示環(huán)氧乙烷對(duì)果蠅生殖細(xì)胞具有一定的誘變作用[7]。

通過對(duì)雄性小鼠及大鼠吸入環(huán)氧乙烷試驗(yàn)顯示，在亞慢性毒性試驗(yàn)中較低濃度EO暴露組均觀察到精子活動(dòng)率下降，提示精子能量代謝發(fā)育狀況受影響，環(huán)氧乙烷各劑量組的精子畸形率均比空白對(duì)照組高，提示精子的正常生長(zhǎng)發(fā)育受到干擾，嚴(yán)重的精子畸形可影響受孕能力[8-9]。

環(huán)氧乙烷是小分子的水溶性化合物（分子量為44），可以容易地通過血睪屏障而影響生殖細(xì)胞；許多研究已證明生殖細(xì)胞的DNA 和蛋白質(zhì)在EO暴露后被烷化而形成有基因毒性的加合物，在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中的顯性致死突變及遺傳性的易位都是EO引起的基因突變。這種突變也可能發(fā)生在基因表達(dá)的分化中，包括遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯后的后幾個(gè)階段。環(huán)氧乙烷可能作用于各級(jí)生精細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)中的巰基，進(jìn)而影響生精細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成生精細(xì)胞發(fā)育障礙和成熟過緩甚至抑制精子的發(fā)生[10]。

3 環(huán)氧乙烷的基因毒性

早在上世紀(jì)90年代Dellarco等報(bào)道了EO在哺乳動(dòng)物測(cè)試系統(tǒng)中導(dǎo)致基因突變和染色體畸變[11]。陸靜芬等通過小鼠吸入EO試驗(yàn)觀察到EO使小鼠骨髓細(xì)胞分裂中的染色體畸變，主要為裂隙、斷裂及斷片, 且隨著濃度的增加而加劇。并發(fā)現(xiàn)染色體斷裂位置較多是在著絲粒區(qū)域，故推測(cè)著絲粒區(qū)可能是受EO影響的染色體敏感區(qū)域，并提出斷裂、斷片現(xiàn)象可作為一個(gè)敏感的遺傳毒理學(xué)參數(shù)，作為測(cè)定受EO毒性影響的染色體損傷指標(biāo)[12]。

Ames試驗(yàn)是一種常規(guī)的遺傳毒性檢測(cè)方法，由于其能檢測(cè)DNA序列的突變，是評(píng)價(jià)化學(xué)物致癌性的重要手段。如圖1所示將Ames試驗(yàn)用于篩選誘變劑：兩種陽(yáng)性誘變劑（左為敵克松，右為疊氮鈉）在不加S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，均可導(dǎo)致測(cè)試菌株的回變菌落數(shù)增多（注：無誘變劑時(shí)，僅見少量自發(fā)突變菌落），說明其具有致突變作用，并且可通過化合物所致回變菌落數(shù)的多少對(duì)其致突變作用的強(qiáng)弱進(jìn)行初步判斷，乃至用于致癌物的篩選。

圖1 Ames試驗(yàn)用于篩選誘變劑。左：TA97菌株陽(yáng)性誘變劑敵克松不加S9的菌落回變數(shù)；右：TA1535菌株陽(yáng)性誘變劑疊氮鈉不加S9的菌落回變數(shù)Fig. 1 Screening of mutagens using Ames test. Left∶ the revertant colonies of TA97 treated by Dexonin without S9; Right∶ the revertant colonies of TA1535 treated by SA without S9

張建軍等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中環(huán)氧乙烷的殘留在活化和非活化兩種條件下均能對(duì)Ames試驗(yàn)中TA100、TA1535菌株有致突變性，表現(xiàn)為TA100菌株的回變菌落數(shù)增多，約為自發(fā)回變數(shù)的1.5倍；TA1535菌株的回變菌落數(shù)增多，約為自發(fā)回變數(shù)的10倍。這表明EO作為直接的烷化劑，具有與DNA和蛋白質(zhì)形成加合物的化學(xué)活性，體內(nèi)外均可導(dǎo)致突變并引發(fā)多物種的致畸變作用[13]。對(duì)于醫(yī)療器械中環(huán)氧乙烷及2-氯乙醇?xì)埩袅康南薅ǎ壳皯?yīng)用最廣泛的標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）制定的ISO 10993-7，該標(biāo)準(zhǔn)等同轉(zhuǎn)化為GB16886.7《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)?第7部分環(huán)氧乙烷滅菌殘留量》。以單個(gè)培養(yǎng)皿質(zhì)量約為16 g計(jì)，EO殘留量約為160μg，以單個(gè)培養(yǎng)皿面積約為64cm2計(jì)，EO殘留量約為640 μg，表明較低劑量下仍具有很強(qiáng)的致突變能力。

發(fā)育毒性是指出生前后接觸外源性理化因素引起的在子代的壽命期內(nèi)出現(xiàn)的任何對(duì)發(fā)育有害的表現(xiàn)。能造成發(fā)育毒性的物質(zhì)稱為發(fā)育毒物。出生前的發(fā)育毒物應(yīng)是在未誘發(fā)母體毒性的劑量下產(chǎn)生發(fā)育毒性的物質(zhì)[14]。在著床前期接觸毒物造成胎兒畸形的例子包括環(huán)氧乙烷、甲基亞硝脲等。著床前期又分為受精、卵裂、囊胚形成，這些過程也正好是體外輔助生殖技術(shù)關(guān)鍵作用時(shí)期。

4 體外輔助生殖用耗材產(chǎn)品EO殘留的風(fēng)險(xiǎn)及控制措施

對(duì)于人類體外輔助生殖用耗材類產(chǎn)品的生物相容性評(píng)價(jià)，目前除了參考GB/T16886系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)的評(píng)價(jià)之外，一般還應(yīng)進(jìn)行體外鼠胚試驗(yàn)和人精子存活試驗(yàn)。然而，對(duì)胚胎毒性的評(píng)價(jià)并不能以細(xì)胞毒性的結(jié)果為依據(jù)，因?yàn)槭茉囄飳?duì)胚胎細(xì)胞的影響并不僅僅體現(xiàn)在細(xì)胞毒性，還體現(xiàn)在細(xì)胞分化等各個(gè)階段的改變，也就是說，受試物產(chǎn)生胚胎毒性和細(xì)胞毒性的劑量是有差別的。有些受試物在抑制胚胎細(xì)胞分化和造成胚胎細(xì)胞毒性的濃度并不同，因此除了對(duì)細(xì)胞毒性評(píng)估之外，通過受試物對(duì)胚胎細(xì)胞的早期階段到最終分化成特定細(xì)胞的全過程的檢測(cè)，可以對(duì)受試物是否具有胚胎毒性做出正確的判斷。

相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)、使用單位及監(jiān)督檢查部門都應(yīng)該對(duì)環(huán)氧乙烷在體外輔助生殖用產(chǎn)品的特殊影響提高防范意識(shí)。此類產(chǎn)品最好不采用環(huán)氧乙烷滅菌。若為環(huán)氧乙烷滅菌，應(yīng)嚴(yán)格規(guī)定紙塑包裝、環(huán)氧乙烷限量及解析時(shí)間，并對(duì)解析時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證。送檢樣品應(yīng)能代表批量產(chǎn)品的解析條件，其檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能反映出批量產(chǎn)品中的殘留量。建議將相關(guān)信息明確在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品放行時(shí)應(yīng)考慮到EO 殘留量，建議對(duì)一年中不同時(shí)期的通風(fēng)、溫度等條件的變化進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，繪制擴(kuò)散曲線，根據(jù)擴(kuò)散曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行放行。

5 總結(jié)

環(huán)氧乙烷的殘留對(duì)體外輔助生殖用相關(guān)醫(yī)療產(chǎn)品的影響比其他醫(yī)療器械更為復(fù)雜，這不僅僅體現(xiàn)在該類器械對(duì)所接觸細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還體現(xiàn)在胚胎細(xì)胞分化各個(gè)階段的改變。因此，對(duì)于體外輔助生殖用醫(yī)療產(chǎn)品中環(huán)氧乙烷殘留的風(fēng)險(xiǎn)分析及控制措施應(yīng)更加審慎。