林翠英，林楊元，張趁華，劉黎星，王守安

(莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，莆田，351100)

在雌性哺乳動物的生殖活動中，孕酮是一種十分重要的性激素，也是早胚發(fā)育的關(guān)鍵因素。孕酮膜受體(membrane progestin receptors, mPRs)能使孕酮產(chǎn)生快速非基因組效應(yīng)。它們屬于類孕激素和脂聯(lián)素分子受體(progestin and adipoQ receptors，PAQRs)家族，存在于細胞膜上，通過調(diào)節(jié)膜腺苷酸環(huán)化酶的活性引起細胞內(nèi) cAMP 的水平變化，而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)[1,2]。本研究通過檢測mPRs在小鼠子宮、輸卵管和卵巢的定位及表達，為進一步探討其在早胚發(fā)育中的作用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物和材料

昆明雌鼠(6～8w) 購自吳氏實驗動物研究中心，飼養(yǎng)3～5d，調(diào)節(jié)生理周期，使其適應(yīng)環(huán)境。抗小鼠mPRs多克隆抗體(Santa Cruz)；S-P超敏試劑盒KIT-9701內(nèi)含A液B液C液D液(邁新試劑公司)；免疫組織化學(xué)攝像系統(tǒng)(Olympus)。TRIZOL試劑、無RNA酶的糖原、SuperScriptTM III reverse transcriptase、5× RT 緩沖液（Invitrogen Life Technologies），RNA酶抑制劑（Epicentre），2.5mmol/L dNTP混合液（dATP，dGTP，dCTP和 dTTP各 2.5mmol/L）（HyTest Ltd），2× PCR master mix（Arraystar），Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems），Primer（英駿生物技術(shù)有限公司），QuantStudio? 5 System (Applied Biosystems)，Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）。

2 免疫組織化學(xué)檢測mPRα、mPRβ和mPRγ 蛋白質(zhì)表達

取6～8w昆明雌鼠以頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出子宮、輸卵管和卵巢，置于10%中性緩沖福爾馬林中固定過夜，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成5μm 厚切片?？竞们衅Ｒ?guī)脫蠟入水，檸檬酸抗原修復(fù)：A液10min、B液15min，4℃一抗過夜，C液10min、D液10min，DAB顯色8min，蘇木素復(fù)染7min，脫水、吹干封片。對照采用PBS 取代一抗，其余步驟同上。

3 實時定量PCR分析mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表達

取6～8w昆明雌鼠陰道涂片區(qū)分動情期和動情間期，以頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出子宮、輸卵管和卵巢，TRIzol 法提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時定量PCR 分析分析mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表 達， 并 以ACTB(-MOUSE) 基因為內(nèi)參照。引物序列如下：ACTB(247bp) ，F(xiàn)-5’ GTACCACCATGTACCCAGGC3’，R-5’ AACGCAGCTCAGTAACAGTCC3’；mPRα(226bp)，F(xiàn)-5’GCACCGCATCATAGTGTCTCC3’，R-5’ ATAATCCAGTGTCACCGCCTCT3’； mPRβ(277bp) ，F(xiàn)-5’TCTATGGAACACTACAGACGCT3’，R-5’ AAGAAGTAGTAACGCCACTCG3’ ；mPRγ(174bp)，F(xiàn)-5’ GGACTATGGTGCCGTCAATC3’，R-5’ TGGAGTTCAAGAAACCTGGAGTA3’。分別進行實時定量 PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成各樣品目的基因和管家基因的濃度，進行校正定量計算結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實時定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用t 檢驗進行組間比較。

結(jié) 果

1 mPRα、mPRβ和mPRγ在子宮、輸卵管和卵巢的定位表達

圖1 小鼠子宮中mPRs 免疫組織化學(xué)表達。A，陰性對照組；B，mPRα；C，mPRβ；D，mPRγ；比例尺，100μmFig. 1 Evaluate mPRs expression in mouse uterus using immunohistochemitry. A, control; B, mPRα; C, mPRβ; D, mPRγ; scale bar, 100μm

免疫組織化學(xué)染色顯示，免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色，陽性細胞易于識別，陰性對照呈陰性反應(yīng)（圖1A和圖2A）。在小鼠子宮內(nèi)，mPRα（圖1B）和mPRβ（圖1C）免疫陽性反應(yīng)分布于內(nèi)膜上皮、腺體上皮和內(nèi)膜基質(zhì)和血管內(nèi)皮，而mPRγ(圖1D)弱陽性反應(yīng)見于腺體上皮和血管內(nèi)皮，其他結(jié)構(gòu)幾乎不著色；在卵巢中，mPRα（圖2B）和mPRβ（圖2C）免疫陽性反應(yīng)見于卵巢間質(zhì)，弱免疫陽性反應(yīng)見于卵母細胞和顆粒細胞，mPRγ未見明顯免疫陽性反應(yīng)（圖2D）；在輸卵管中，三種蛋白均未見明顯免疫陽性反應(yīng)。

圖2 小鼠卵巢中mPRs 免疫組織化學(xué)表達。A，PBS陰性對照組；B，mPRα；C，mPRβ；D，mPRγ；比例尺，100μmFig. 2 Evaluate mPRs expression in mouse ovary using immunohistochemitry. A, PBS control; B, mPRα; C, mPRβ; D, mPRγ; scale bar, 100μm

2 mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA在子宮、輸卵管和卵巢的表達

實時定量PCR檢測顯示，在子宮、輸卵管和卵巢中，mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA均有表達，mPRβ mRNA表達水平高于mPRα和mPRγ mRNA。對比，3種組織內(nèi)mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表達水平在動情期和動情間期之間無顯著差異（圖3-圖5）。

圖3 小鼠子宮中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表達水平比較。*，P＜0.01Fig. 3 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse uterus, *, P＜0.01

圖4 小鼠卵巢中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表達水平比較。*，P＜0.01Fig. 4 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse ovary, *, P＜0.01

討 論

mPRs的表達、分布及功能在魚類及兩棲類中研究較為深入，然而其在哺乳動物生殖系統(tǒng)表達、分布及功能研究剛剛起步。PAQR7、PAQR8和PAQR5又稱孕激素膜受體mPRα、mPRβ和mPRγ，參與孕激素的快速調(diào)節(jié)作用。mPRα是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的孕激素膜受體，該蛋白質(zhì)具有和 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）相似的 7 次跨膜結(jié)構(gòu)域[3]，N 端是糖基化位點和半胱氨酸殘基保守區(qū)域。mPRα能與抑制性G 蛋白（Gi）直接耦聯(lián)，能激活Gi 降低腺苷酸激酶的活性，使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)合成減少，激活p42MAPK 及PI3K 途徑，而產(chǎn)生生物學(xué)作用[1,2]。mPRα主要表達在生殖器官，包括卵巢和睪丸[2-7]。孕酮加速進入生殖細胞減數(shù)分裂的作用很可能由mPR介導(dǎo)[4-7]。mPRα在調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程起重要作用，它能快速誘導(dǎo)卵細胞減數(shù)分裂，抑制顆粒細胞調(diào)亡[4]。Hagiwara等研究發(fā)現(xiàn)，在24h產(chǎn)卵周期中，整個卵巢和排卵前濾泡的mPRα 和 mPRγ的轉(zhuǎn)錄本始終保持相對穩(wěn)定水平[5]。半光滑舌鰨魚卵巢中克隆的cDNA，能編碼新型的PAQR，其結(jié)構(gòu)與mPRα (Paqr7)相似，進化過程中介于mPRα和mPRβ之間的中間產(chǎn)物，暫稱為Paqr7b。Paqr7b對調(diào)節(jié)舌鰨魚卵母細胞成熟有重要作用，它可能對生殖系統(tǒng)的其他方面（比如腦垂體功能）也有影響[6]。有研究顯示雞胚卵內(nèi)表達mPRα，和mPRβ的mRNAs表達比mPRγ更高；mPRα免疫陽性細胞主要散在卵巢皮質(zhì)區(qū)域，即生殖細胞分布的最大區(qū)域，mPRβ免疫反應(yīng)陽性細胞廣泛分布在卵巢內(nèi)，免疫陽性細胞主要聚集在形態(tài)相似的生殖細胞群集，提示孕酮可能主要通過mPRs調(diào)節(jié)原始胚胎生殖細胞減數(shù)分裂啟動[7]。因此，在孕酮調(diào)節(jié)生殖功能活動過程中，mPRs介導(dǎo)的快速非基因效應(yīng)有著重要的作用。

圖5 小鼠輸卵管中mPRα、mPRβ和mPRγ mRNA表達水平比較。*，P＜0.01Fig. 5 mRNA expression levels of mPRα, mPRβ and mPRγ in mouse oviduct. *, P＜0.01

我們對小鼠生殖系統(tǒng)中mPRα、mPRβ和mPRγ的表達檢測顯示，在小鼠子宮內(nèi)，mPRα、mPRβ免疫陽性反應(yīng)分布于內(nèi)膜上皮、腺體上皮、內(nèi)膜基質(zhì)和血管內(nèi)皮，而mPRγ弱免疫陽性反應(yīng)見于腺體上皮和血管內(nèi)皮；在卵巢中，mPRα、β免疫陽性反應(yīng)見于卵巢間質(zhì)、卵母細胞、顆粒細胞和血管內(nèi)皮，mPRγ而未見明顯免疫陽性反應(yīng)；mPRβ的mRNAs表達水平高于mPRα和mPRγ。這些結(jié)果提示，在小鼠生殖系統(tǒng)中，孕酮的非基因效應(yīng)可能更多依賴mPRα、mPRβ的介導(dǎo)，尤其是mPRβ。mPRα、mPRβ和mPRγ在血管內(nèi)皮均呈免疫陽性反應(yīng)，提示可能參與器官血流量的調(diào)節(jié)。Kowalik等對牛輸卵管內(nèi)孕酮膜受體的研究顯示，輸卵管同側(cè)和對側(cè)mPRα、mPRβ和mPRγ的mRNA表達沒有差異，而在發(fā)情周期的不同階段輸卵管同一處的表達不同，mPRα的mRNA在濾泡期比黃體中期表達更高，mPRα和mPRβ的mRNA在傘部比峽部表達更高[8]。對黃體中期和濾泡期的雙側(cè)輸卵管各部的免疫組織化學(xué)定位檢測顯示，mPRα、mPRβ和mPRγ在黃體中期及濾泡期的不同側(cè)輸卵管的各部反應(yīng)強度和細胞定位沒有顯著差別；輸卵管的腔細胞呈強陽性反應(yīng)，而肌細胞和間質(zhì)細胞則呈陰性反應(yīng)。所有的蛋白質(zhì)都定位在輸卵管內(nèi)皮細胞，表明孕酮膜受體可能參與調(diào)節(jié)輸卵管的運動、分泌功能以及器官的血流量[8]。本研究在小鼠輸卵管中，三種蛋白均未見明顯免疫陽性反應(yīng)， 而mRNAs均有表達，mPRβ表達水平高于mPRα和mPRγ。這可能與mPRs在血管內(nèi)皮表達有關(guān)，孕酮在小鼠輸卵管中可能通過血管內(nèi)mPRs起作用。

總之，本研究顯示mPRα和mPRβ蛋白在小鼠卵巢和子宮中均有表達，且表達水平不隨動情周期改變，提示它們可能構(gòu)成小鼠孕酮的快速非基因效應(yīng)的重要分子，為早期胚胎在子宮內(nèi)發(fā)育提供穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，其具體的作用機制還有待進一步研究。