崔 杰 林 煜 徐艷春 楊淑慧

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是指在DNA聚合酶的催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程[1]，是一項能夠快速、特異地在體外擴增目的DNA的技術，是生物學研究中應用最為廣泛的實驗室技術之一[2-4]。

PCR產物經常需要經過克隆后進行測序或其他分析?？寺r將PCR產物與特定載體DNA分子連接，形成重組DNA分子，轉入感受態(tài)細胞中通過細胞和質粒的不斷復制，生成大量目標分子[5-7]。隨著新型載體的不斷出現(xiàn)，如T-載體等，在很大程度上簡化了PCR產物的克隆過程，同時也提高了克隆效率[8-10]。

但是，PCR并不總是完全忠實的，除了引物與模板的非特異結合產生非特異性擴增產物以外，因為模板的高級結構、聚合酶的某些屬性等，還經常會介導DNA的重組(recombination)、復制滑動(slippage)和跳躍(jumping)等[11]。

重組是DNA聚合酶在按照模板合成新鏈的時候，因為另一條與模板序列高度相似的片段與模板在空間上接近，聚合酶從原來的模板鏈上移動到該片段上繼續(xù)合成新鏈，最終使PCR產物成為兩個不同模板鏈的重組產物[12]。復制滑動在微衛(wèi)星等短串聯(lián)重復序列的擴增中十分常見，DNA聚合酶在合成新鏈時越過一個或幾個重復單位，造成PCR產物比模板鏈縮短重復單位整數(shù)倍[13]。

跳躍擴增是當模板DNA自身因為同原序列形成較為穩(wěn)定的環(huán)形局部二級結構，新鏈合成時DNA聚合酶移動到該區(qū)域后，就可能跨過這個環(huán)形區(qū)繼續(xù)向下合成新鏈，從而使PCR產物較模板丟失了一個片段[14]。這種現(xiàn)象最早報道的是Cariello et al(1991)在擴增人18S rDNA基因時發(fā)現(xiàn)了中間缺失54 bp的異常產物[15]。與微衛(wèi)星等短串聯(lián)重復序列的滑動相比，較大片段的跳躍更難發(fā)生，在實驗中也十分罕見。正因如此，PCR的跳躍問題常常被忽視，造成錯誤結果。

PCR產物的克隆是利用細菌內的DNA聚合酶等復制體系，將目標DNA片段進行在體復制。因為細菌復制體系的忠實性遠高于一般的TaqDNA聚合酶(無3′-5′外切酶活性)，所以利用質粒復制進行分子克隆通常認為是十分精準的。然而，在特殊情況下，如目標分子中含有某些特殊的回文結構時，細菌質粒在復制過程中也會出現(xiàn)跳躍或滑動[16]。

我們在研究黑斑側褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)抗菌肽Temporin基因結構時，曾遇到在PCR擴增和擴增產物T-A克隆過程中同時出現(xiàn)跳躍而引起長達560 bp的片段缺失，并發(fā)現(xiàn)與一段6 bp的重復單元有關。我們報道這一實驗結果，為更多的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品

2015年，在吉林、長白山、佳木斯、富錦、銀川、西安、太原等20個地區(qū)采集成年黑斑側褶蛙，每個地區(qū)采集5只，野外雙毀髓處死后立即采集后腿肌肉樣品于液氮中保存，然后轉移至-80℃冰箱中保存。

1.2 總DNA的提取

取20 mg肌肉組織剪碎后分別加入25 μL Proteinase K(10 mg/mL)、35 μL SDS(10%)、295 μL TNE buffer(pH=8)，充分混勻后瞬時離心，56℃水浴消化1 h。消化液采用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep，杭州)提取總DNA，操作按照說明書進行。

1.3 PCR反應

采用DNAstar軟件包的Primer Select軟件，以黑斑側褶蛙抗菌肽 Temporin基因序列為模板設計該基因內含子的擴增引物[17-18]，上游引物C2：GCAGCAGCTGAAACACTGAAT，下游引物D2：AGTTATACCAATTGTGTCAGGTC。反應體系為：PimeSTAR MAX(Takara，大連)25μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板(10 ng/μL)5.0 μL，ddH2O 18 μL。反應程序為：94℃/5 min，(94℃/30 s，55℃/1 min，72℃/2 min)×35cycle，72℃/10 min。

1.4 PCR產物的克隆

PCP產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep(AxyPrep，杭州)DNA純化回收試劑盒回收，用pEASY-T5 Zero試劑盒(TransGen Biotech，北京)進行克隆，反應體系為5 μL，組分包括PCR產物1～4 μL、pEASY-T5 Zero cloning vector 1 μL。在25℃恒溫條件下反應20～30 min。轉化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞后，在LB液體培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)過夜。陽性質粒經過1.3中相同的PCR方法鑒定后，采用Sanger法，使用M13+/M13-測序引物進行雙向測序。

1.5 質粒提取與限制性雙酶切

取700 μL過夜培養(yǎng)的菌液于2 mL離心管中10000 xg離心5 min，棄上清液。用350 μL PBS懸浮菌體細胞，具體操作按照AxyPrep質粒小量DNA提取試劑盒(AxyPrep，杭州)使用說明書進行。

根據(jù)pEASY-T5 Zero cloning vector自帶酶切位點，采用PstI(5′...CTGCA↓G...3′)和NotI(5′...GC↓GGCCGC...3′)對質粒進行雙酶，反應體系為：PstI 1 μL、NotI 1 μL、10 xFlyCut Buffer 5 μL、質粒DNA 20μL和ddH2O 25 μL，37℃孵育10 min。加入10 xDNA Loading Buffer至終濃度為1 x終止反應，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。

1.6 測序結果分析

測得的原始序列用DNAstar軟件包中EditSeq去掉隆載體序列和引物序列。用MegAlign軟件將獲得的DNA序列與已有的參考序列進行對比，確定序列的正確性。至少3個克隆序列完全一致時才被確定為一個最終的DNA序列。采用RepeatAround 2.1軟件查找和統(tǒng)計DNA序列中重復單元的性質、種類和重復次數(shù)[19]。

2 結果

如圖1，PCR產物經瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，大約有73%的個體在1200 bp和550 bp處同時出現(xiàn)清晰的兩條帶，18%個體較短的條帶信號稍弱，9%的個體只有1200 bp的條帶。將兩處條帶分別回收后并測序，結果顯示較長的條帶為1126 bp，較短的條帶為562 bp，后者是在前者198 bp處開始缺失564 bp而成。

在后續(xù)實驗中，對22個個體進行PCR擴增，雖然退火溫度經過稍許調整，使用SuperMix(TransGen Biotech，北京)、High Fidelity DNA Polymerase(TransGen Biotech，北京)、LA Taq(Takara，大連)等不同的DNA聚合酶進行擴增，發(fā)現(xiàn)依然會有3種情況出現(xiàn)，基本沒有變化，由此將二者推斷為兩個不同的等位基因。

但在對長片段進行Sanger測序時發(fā)現(xiàn)一種異?，F(xiàn)象，模板實際長度為1126 bp，但測序結果中有時會只得到562 bp的短片段序列。該短序列是長片段在的198 bp處開始缺失564 bp而成。這表明短片段極有可能是PCR造成的一種假象，即在擴增反應中發(fā)生了片段缺失。

為了進一步驗證這個缺失來自PCR過程，我們用回收的長片段作為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物時發(fā)現(xiàn)3種情況，一是僅得到1126 bp的長片段，一是僅得到562 bp的短片段，再者兩個片段同時出現(xiàn)(圖2)，對PCR產物測序也證明了這一點。

圖2 以1126 bp的長片段為模板的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophorogram of the products of PCR templated with a 1126 bp fragment M為Marker DL2000，N為陰性對照(H2O)；顯示絕大多數(shù)擴增產物含有1126 bp的目的條帶以外，還出現(xiàn)一個短片段(測序顯示為560 bp)，否定了圖1中關于兩個等位基因的推斷 Showing that the PCR products from most samples contained two fragments，again corresponding to 1126 bp and 562 bp.This conflicts with the hypothesis that these are two different alleles because there is also a short fragment(sequencing showed 560 bp)that invalidates the deduction of two alleles as suggested by Fig 1.M is molecular marker DL2000，N is negative control(H2O)

為了完全排除模板污染的可能性，我們對長片段純化回收之后進行了T-A克隆。提取陽性克隆的質粒后，用限制性內切酶Pst I和Not I把PCR產物從載體上切下來，再經瓊脂糖電泳檢測發(fā)現(xiàn)，陽性克隆中含有兩種克隆片段，一種是含有與長片段完全相同的克隆片段，一種是與短片段完全相同的克隆片段(圖3)。也就是說，1126 bp長的目的片段在不同菌落中，變成大小兩種片段。測序表明，短片段仍然是長片段在198 bp處缺失564 bp而成。這表明，這個1126 bp長的片段不僅在PCR擴增過程中可以發(fā)生缺失，而且在大腸桿菌內的質粒復制過程中也能夠發(fā)生缺失，這種現(xiàn)象十分罕見。

利用軟件RepeatAround 2.1對1126 bp的片段進行重復序列分析，結果顯示，該序列具有同向重復序列(direct repeats)70種、反向重復序列(inverse repeats)13種、鏡像重復序列(mirror repeats)21種和互補重復序列(complementary repeats)21種(表1)。將1126 bp和526 bp的兩個片段的序列進行比對發(fā)現(xiàn)，兩個序列在缺失片段的上游和末端，分別有一個6 bp的同向重復序列5′-AGACCT-3′(圖4)，是序列缺失發(fā)生的位置，至此我們推測DNA復制到第二個重復序列的時候發(fā)生了跳躍(PCR Jumping)。

圖3 陽性質粒的酶切電泳圖Fig.3 Electrophorogram electrophoresis of positive plasmids 以1126 bp片段作為插入片段在質粒中進行克隆后，用限制性內切酶Pst I和Not I切割質粒，發(fā)現(xiàn)插入片段在一些克隆里保持1126 bp(1中的條帶B)，而在另一些克隆里變成526 bp(2中的條帶C)，條帶A為酶切后的載體；M為Marker DL2000 While a 1126 bp fragment was cloned using pEASY-T5 Zero cloning vector，plasmids extracted from different positive clones contained two fragments of different sizes，i.e.，a 1126 bp true fragment(B)and a 526 bp pseudo-fragment generated during replication jumping(C)after double digested with the restriction enzymes Pst I and Not I.Band A is the vector，M is molecular marker DL2000

此外，序列比對還發(fā)現(xiàn)，在對應于長片段的894 bp位置開始，有一個4 bp(5′-TGCT-3′)的短片段的插入，而且無論采用總DNA作為模板擴增，還是采用單克隆長片段作為模板擴增，還是將單克隆長片段進行再克隆，只要出現(xiàn)片段缺失，就會出現(xiàn)這一插入序列，提示這一插入與片段缺失密切相關。

表1 黑斑側褶蛙Temporin基因內含子1126 bp的長片段中可能引起跳躍的重復序列的情況統(tǒng)計

Tab.1 Repeat sequences predicted capable of inducing replicationjumping in the 1126 bp fragment on the intron of the Temporingene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus)

續(xù)表1

3 討論

DNA序列的重復方式可以分為同向重復，反向重復，鏡像重復和互補重復，如果在適當條件下形成必要的二級或更高級結構，其中一些序列可能導致復制跳躍或者滑動[20]。本研究中的1126 bp片段中檢測到665種不同的重復序列(表1)，但是多次反復擴增中，只在第194～199 bp位置上和第757～762 bp的位置上出現(xiàn)的重復序列5′-AGACCT-3′處發(fā)生了跳躍，使得擴增產物缺失了564 bp。 令人驚訝的是，由這對重復引起的跳躍在體外和體內復制都會產生。

Canceill等人提出了兩種復制跳躍模型[21]。一種是與親本雙鏈形成發(fā)夾結構相關。子鏈合成在形成發(fā)夾結構的堿基處被封閉，然后在雙鏈瞬時打開后經由DNA聚合酶的鏈置換活性繼續(xù)，最后滑過發(fā)夾結構。然而，親本雙螺旋模型似乎不適用于我們的復制跳躍事件，因為在我們的研究中，子鏈中缺失了一個重復序列。這表明重復序列之一被并入發(fā)夾結構中，但是，在我們的研究中，第一次重復之后或第二次重復之前的序列都不能與重復序列形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構(圖5A和5B)。

另一種模型就是異雙螺旋模型，在第一次重復的時候阻斷了子鏈合成，同時DNA聚合酶和子鏈從模板上脫落，下一個循環(huán)中，新鏈作為互補鏈，與第二個重復單位相配對、退火，并成為引物，DNA聚合酶再次結合，從第二個重復單位的下游開始完成新鏈的延伸[22]。這種情況很符合我們研究中的缺失現(xiàn)象，因為這種情況下子鏈中缺失一個重復序列，與我們的情況一致。我們的結果和模型之間唯一的差異是發(fā)夾底部的弱雙鏈體。據(jù)報道，DNA聚合酶的脫落和鏈延伸的阻斷可能不是真正由于發(fā)夾導致的，而是由DNA模板的許多二級和高級結構導致[22-23]。由于在DNA復制的時候出現(xiàn)了這樣的結構，才導致了跳躍的發(fā)生(圖5C)。我們無法對這一預測做進一步測試，但我們推測高級結構誘導的子鏈合成阻斷和聚合酶脫落都與重復序列相關，而且這種現(xiàn)象在體內和體外復制時都會發(fā)生。

DNA聚合酶產生跳躍的能力與其鏈置換活性有關，鏈置換活性越高，跳躍能力越低，反之亦然[21]。在細菌體內進行質粒復制時，DNA聚合酶III(復制早期有時是DNA聚合酶I)[24]進行新鏈延伸時，因其鏈置換活性不是很高[25]，在遇到模板上合適的高級結構時更容易脫落下來，脫落后也可以在新鏈與附近的另一個同源序列(本研究中的第二個重復單位)重新退火后再次結合上去，并完成鏈的延伸而產生跳躍。本研究中單克隆DNA片段再次克隆時，所發(fā)生的跳躍很可能屬于這一情形(圖5C)事實上，常用于PCR，Sanger測序或分子克隆的DNA聚合酶的類型比如TaqDNA聚合酶，DNA聚合酶II，T4聚合酶等不具有高的鏈置換活性[21，26]。 因此，當模板序列具備促進形成易于跳躍的高結構，在這些酶參與復制的情況下也容易發(fā)生復制跳躍。

本研究所遇到的復制跳躍不僅發(fā)生在Temporin基因內含子雙向擴增中，也發(fā)生在Sanger測序時的單鏈擴增中，甚至也發(fā)生在細菌體內質粒復制的過程中?；谖覀冏隽舜_認實驗，使用純化的1126 bp片段作為模板用于再擴增，并且雙酶消化陽性質粒，得出了這個結論，否則，跳躍可能被誤解為獨立的等位基因。所以，我們建議在利用片段大小進行二倍體或多倍體基因分型時，應該首先選取片段較大的等位基因進行克隆制備成單一模板，再用單一模板和已經開發(fā)出的具有強置換活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶[24，26]進行PCR擴增或再克隆后做質粒酶切，來確認是否發(fā)生復制跳躍，避免分型錯誤。

圖4 Temporin基因內含子發(fā)生復制跳躍前后的序列比較Fig.4 Allignment of the true and jumped sequences of the intron of the Temporin gene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus) TempLong為原初序列；TempShort為復制跳躍導致TempLong丟失了564 bp；方框中是丟失片段之前和末尾的6 bp同向重復序列，圓圈中是4 bp的插入序列 TempLong is the true sequence；TempShort is the jumped sequence from TempLong.Two 6 bp direct repeat sequences are enclosed in square boxes and the 4 bp insert is enclosed in an oval

圖5 產生擴增跳躍和克隆跳躍的機制示意圖Fig.5 Schematic diagram of the mechanism of replication jumps on the intron fragment of the Temporin gene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus) A.第一個重復單位下游的序列與第二個重復單位配對后形成發(fā)夾環(huán)形結構，DNA聚合酶直接越過發(fā)夾延伸新鏈，形成缺失的新鏈；B.第二個重復單元的下游序列與第一個重復單元配對形成一個發(fā)夾環(huán)，而DNA聚合酶將新鏈直接穿過發(fā)夾，形成一個缺失的新鏈；C.模板上兩個重復單位下相互靠近，形成特定的高級結構，使DNA聚合酶脫落下來，新鏈延伸被阻斷。在進行PCR擴增時，下一個循環(huán)中新鏈的第一個重復單位與模板的第二個重復單位互補配對并退火，成為引物，DNA聚合酶結合后繼續(xù)延伸，形成缺失的PCR產物；在質粒復制時，新鏈的重復單位移動到模板的第二個重復單位并退火，DNA聚合酶再次結合并完成延伸，形成缺失的新鏈 A.The sequence downstream of the first repeat unit is paired with the second repeat unit to form a hairpin loop，and DNA polymerase extends the new strand directly across the hairpin to form a missing new strand.B.The sequence downstream of the second repeat unit is paired with the first repeat unit to form a hairpin loop，and DNA polymerase extends the new strand directly across the hairpin to form a missing new strand.C.The two repeat units of the template approach each other to form a specific high-level structure.The DNA polymerase sheds and the new chain extension is blocked.The first repeat unit of the new strand in the next cycle anneals to the second repeat unit acting as a primer for strand extension when DNA polymerase is reloaded.As a result，the segment between the two repeats is missing from the PCR product.In the case of plasmid replication，the repeat unit of the new strand moves to the second repeat unit of the template and annealed allowing reloaded DNA polymerase complete the extension that leads to the segment missing from the new strand

致謝：首先，感謝國家自然科學基金項目(31370393)對本研究的大力支持。同時，感謝國家林業(yè)局野生動物檢測中心為本研究提供實驗設備，也感謝檢測中心馬躍老師的悉心幫助。