盛清宇 孫鐵鐸 張崇穎 羅理楊 姜廣順

(1.國家林業(yè)局貓科動物研究中心，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計研究院，長春，130021；3.吉林省天橋嶺林業(yè)局，汪清，133204)

狍(Capreolusspp.)是鹿科(Cervidae)中分布最廣泛的動物之一，包括2個種，即體型相對較小的歐洲狍(Capreoluscapreolus)以及體型相對較大的西伯利亞狍(Capreoluspygargus)。西伯利亞狍的主要分布區(qū)域包括整個亞洲大陸的古北界[1]及東歐的部分地區(qū)[2]。在中國，狍廣泛分布于東北區(qū)大興安嶺亞區(qū)、長白山地亞區(qū)、松遼平原亞區(qū)、華北區(qū)黃淮平原亞區(qū)、黃土高原亞區(qū)、蒙新區(qū)天山山地亞區(qū)、青藏區(qū)青海藏南亞區(qū)，同時存在部分邊緣分布于西南區(qū)南山地亞區(qū)及華中區(qū)東部丘陵平原亞區(qū)[3]。在東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)分布區(qū)域內(nèi)，狍也有廣泛分布，并構(gòu)成了東北豹的主要獵物(占食物構(gòu)成的66%)以及東北虎的獵物之一(占食物構(gòu)成的9%)[4]。因此，研究狍的種群遺傳多樣性，對于探究獵物種群有效恢復(fù)，對東北虎、東北豹種群的保護(hù)有著重要的意義。

目前，已經(jīng)有許多關(guān)于歐洲狍種群遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)的研究[5-7]，這些研究利用線粒體DNA和微衛(wèi)星作為分子標(biāo)記，揭示了歐洲狍種群的遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布差異。而關(guān)于西伯利亞狍的種群遺傳學(xué)研究，不管在國外還是國內(nèi)都相對較少，且一般是使用線粒體DNA作為分子標(biāo)記，而較少選擇微衛(wèi)星標(biāo)記來進(jìn)行研究[8-10]。

微衛(wèi)星是由2～5個核苷酸串聯(lián)的重復(fù)序列構(gòu)成，由于其廣泛分布于基因組中，在長度上具有明顯的多態(tài)性[11]，并且是進(jìn)化最快的DNA序列之一[12-14]。因此，是研究種群結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系的有力工具[15]。目前，有不少利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析歐洲狍種群遺傳學(xué)的研究，如Randi等通過微衛(wèi)星STR數(shù)據(jù)揭示了在伊比利亞北部和意大利南部的狍種群之間的遺傳差異[16]；Baker和Hoelzel使用線粒體DNA和微衛(wèi)星標(biāo)記的研究方法，比較了英國原有的狍種群和引入種群之間的遺傳多樣性差異以及種群混合和擴散[17]。關(guān)于西伯利亞狍種群遺傳學(xué)的研究目前相對較少，Lee等對亞洲10個地區(qū)西伯利亞狍的12個微衛(wèi)星位點的變異進(jìn)行了研究，分析了各個種群的遺傳多樣性水平，基于貝葉斯的聚類分析揭示了西伯利亞狍存在的3個不同地理種群，分別是東南部種群(包括朝鮮半島、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、跨拜加爾省和蒙古北部地區(qū))、西北部種群(包括西伯利亞西部和俄羅斯的烏拉爾)以及韓國濟州島種群[18]?？偟膩碚f，目前國內(nèi)利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析西伯利亞狍種群遺傳多樣性的報道相對空白。鑒于此，本研究利用10個微衛(wèi)星位點，結(jié)合熒光標(biāo)記PCR技術(shù)，對東北虎、東北豹分布區(qū)域內(nèi)的西伯利亞狍種群進(jìn)行了局域種群遺傳多態(tài)性的研究，目的在于為狍種群資源的保存利用以及后續(xù)研究狍作為獵物對東北虎、東北豹的影響提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在2014年12月～2017年3月期間，在冬季外業(yè)過程中采集了共計329份西伯利亞狍的糞便樣品，分布的區(qū)域包括黃泥河、琿春、汪清、穆棱、東京城、天橋嶺、東寧。樣品采集區(qū)域見圖1。所用糞便樣品均在冬季采集，并保存于-20℃的條件下，用于后續(xù)實驗步驟。

1.2 糞便DNA提取、電泳檢測

采用QIA amp DNA Stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Germany)提取DNA，電泳檢測后使用提取效果好的進(jìn)行PCR擴增，第一次提取后質(zhì)量不高的樣品重新提取DNA。329份樣品中，共計287份成功提取DNA，用于后續(xù)實驗步驟。

圖1 研究地區(qū)地理位置示意圖Fig.1 Location of study area

1.3 微衛(wèi)星位點及引物選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-22]，選取了10個微衛(wèi)星位點并合成引物，進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。引物序列信息見表1。

1.4 PCR擴增

采用由新?；驒z測有限公司合成的10對引物，分別對DNA樣品進(jìn)行3次以上的PCR重復(fù)擴增。PCR反應(yīng)總體系20 μL：10×PCR Buffer 10 μL，dNTPMixture(2.5 mmol/L)4 μL，上/下游引物(10 mmol/L)各0.75 μL，TOYOBO高保真酶0.3 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O補足體系。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，55～58℃退火1 min，68℃延伸1 min，35 個循環(huán)；68℃延伸10 min。擴增完畢后，取5 μL PCR產(chǎn)物在含有核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳檢測以確定PCR擴增是否成功；將擴增成功的樣品送至上海生工生物有限公司，將混合液在ABI3730X1 測序儀上進(jìn)行測序分型。

1.5 統(tǒng)計分析

利用 FSTAT(v.2.9.3)軟件、Cervus軟件統(tǒng)計遺傳參數(shù)，包括等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、脫離種群數(shù)量影響的等位基因豐富度(allele richness，AR)以及各種群固定系數(shù)(fixation index)。利用FSTAT (v.2.9.3)軟件計算兩兩種群之間的FST統(tǒng)計量[23]，用于表征種群遺傳分化的水平。

表1 西伯利亞狍種群10個微衛(wèi)星位點的相關(guān)信息及退火溫度

Tab.1 Information and annealing temperature of 10 microsatellite loci from Siberian roe deer

2 結(jié)果與分析

2.1 分型結(jié)果

利用ABI3730X1 測序儀對每個樣品不同微衛(wèi)星位點的熒光標(biāo)記 PCR 擴增產(chǎn)物進(jìn)行微衛(wèi)星樣本分型結(jié)果的獲取，使用GeneMarker軟件對這些微衛(wèi)星樣品的分型結(jié)果進(jìn)行判讀，得出了10個微衛(wèi)星位點的擴增產(chǎn)物電泳信號圖，選取部分信號圖如圖2所示。所顯示的信號圖表明微衛(wèi)星DNA擴增所得的條帶清晰，電泳信號較強，實驗結(jié)果是可靠的，可用于下一步數(shù)據(jù)分析。

2.2 微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性分析

本研究所使用的10個微衛(wèi)星位點在西伯利亞狍種群中檢測到的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)以及固定系數(shù)(fixation index)結(jié)果見表2。10個基因座位的等位基因數(shù)為4.1～17.1，平均等位基因數(shù)為9.6。其中，等位基因數(shù)最多的位點是BM757，有17個等位基因，最少的位點是MCM507，有4個等位基因。所檢測到的10個座位中的平均多態(tài)信息含量為0.73，多態(tài)信息含量最高的位點是BM757(0.93)，最低的位點是MCM507(0.33)。

圖2 微衛(wèi)星位點擴増產(chǎn)物電泳信號圖Fig.2 Signal figure of microsatellite loci tested by capillary electrophoresis

表2 西伯利亞狍種群10個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.2 Genetic diversity parameters of 10 microsatellite loci from Siberian roe deer population

2.3 種群的遺傳多樣性分析

本研究所得到的7個西伯利亞狍局域種群的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、脫離種群數(shù)量影響的等位基因豐富度(allele richness，AR)以及各種群固定系數(shù)(fixation index)結(jié)果見表3。由表3可知，東北地區(qū)西伯利亞狍種群的等位基因數(shù)在7.3～11.1之間，平均等位基因數(shù)為8.9。等位基因豐富度整體水平較高，為7.5，其中，水平最高的是東寧地區(qū)種群的8.4，水平最低的是黃泥河地區(qū)種群的6.14。觀測雜合度和期望雜合度變化范圍在0.7～0.76之間，觀測雜合度小于期望雜合度，處于較高水平，并且兩者之間未表現(xiàn)出明顯的偏離。固定指數(shù)的變化范圍在-0.01～0.061之間。

表3 東北地區(qū)7個西伯利亞狍種群遺傳多樣性參數(shù)

Tab.3 Genetic diversity parameters of 7 Siberian roe deer populations in northeast China

2.4 種群結(jié)構(gòu)

FST評估表明東北地區(qū)狍種群之間存在較小至中等程度的遺傳分化(表4)。FST值的變化范圍在0.002～0.074之間，其中，黃泥河地區(qū)的狍種群與其他6個地區(qū)的狍種群均存在中等程度的遺傳分化，而剩余6個地區(qū)的種群之間遺傳分化程度相對較低。

表4 種群間遺傳分化系數(shù) FST

Tab.4 Population comparisons with FST values

3 討論

多態(tài)信息含量(PIC)是用以描述微衛(wèi)星位點多態(tài)性大小的尺度，Botstein等[24]的研究表明，當(dāng)PIC>0.5時，認(rèn)為該基因座位為高度多態(tài)位點，當(dāng)0.25

雜合度(H)是衡量種群內(nèi)遺傳變異大小的一項可靠指標(biāo)，其中，期望雜合度值能夠直接反映種群內(nèi)個體的均勻度，雜合度值越高，則種群內(nèi)的遺傳變異程度越高，雜合度值越低，則種群內(nèi)的遺傳變異程度越低[25]。一般情況下觀測雜合度與期望雜合度越接近，表明該種群受外界因素或近交等的影響越小。本研究所得出的東北地區(qū)西伯利亞狍種群的平均觀測雜合度(0.72)比期望雜合度(0.75)低，7個種群中，除黃泥河地區(qū)的狍種群觀測雜合度與期望雜合度相同之外，其余6個種群的觀測雜合度均低于期望雜合度，且各地理種群的期望雜合度和觀測雜合度之間不存在顯著差異，直接排出了各種群存在近交的可能性。

從等位基因豐富度來分析，亞洲其他地區(qū)(韓國、俄羅斯、蒙古)西伯利亞狍種群的平均等位基因豐富度為3.68[18]，歐洲狍種群的平均等位基因豐富度為4.1[26]，而本研究所得到的東北地區(qū)西伯利亞狍7個種群的平均等位基因豐富度為7.5，明顯高于歐洲狍種群以及亞洲其他地區(qū)的西伯利亞狍種群。從雜合度水平來分析，亞洲其他地區(qū)(韓國、俄羅斯、蒙古)西伯利亞狍種群的觀測雜合度在0.329～0.628之間[18]，歐洲狍種群的觀測雜合度在0.391～0.686之間[26]，其中英國地區(qū)種群的觀測雜合度在0.49～0.74之間[17]。本研究得到的7個種群的觀測雜合度的變化范圍在0.70～0.74之間，高于亞洲其他地區(qū)西伯利亞狍種群以及歐洲狍種群。研究結(jié)果表明，東北地區(qū)西伯利亞狍種群遺傳一致性較低，種群遺傳多樣性相對豐富、變異程度較高。

固定指數(shù)(Fis)也被稱為雜合子缺乏系數(shù)，一般被用于評估種群內(nèi)個體間的近交情況，為-1，則表明種群內(nèi)全部為雜合子，F(xiàn)is值為1，則種群內(nèi)全部為純合子。研究結(jié)果顯示，東北地區(qū)西伯利亞狍7個種群中，僅黃泥河種群的Fis值為負(fù)值(-0.01)，其余6個種群的Fis值均>0，在0.021～0.061之間。英國地區(qū)歐洲狍種群的Fis值的變化范圍為-0.044～0.091[17]，亞洲其他地區(qū)西伯利亞狍種群的Fis值均大于0，在0.031～0.247之間[18]?？梢钥闯?，東北地區(qū)西伯利亞狍種群的Fis值變化范圍與其他地區(qū)狍種群的Fis值比較一致，可能存在一定程度的近交。

本研究還發(fā)現(xiàn)調(diào)查區(qū)域內(nèi)7個西伯利亞狍種群之間的遺傳分化程度較低(FST=0.002～0.074)，低于亞洲其他地區(qū)西伯利亞狍種群之間的遺傳分化程度(0.002～0.412)[18]。需要指出的是，本研究未發(fā)現(xiàn)7個西伯利亞狍種群之間存在顯著的遺傳分化，在后續(xù)研究中，需要進(jìn)一步分析各種群遺傳差異的變異來源以及種群間的基因流情況，以探究各種群之間的交流水平。同時拓展研究區(qū)域，在更大范圍內(nèi)探究其他地區(qū)西伯利亞狍種群與本研究7個種群之間的遺傳多樣性差異、遺傳分化以及基因流情況。

4 結(jié)論

本研究初步建立了東北地區(qū)西伯利亞狍種群10個微衛(wèi)星位點的遺傳基礎(chǔ)，研究結(jié)果表明東北地區(qū)西伯利亞狍種群具有較高的遺傳多樣性，遺傳信息豐富：雜合度水平和等位基因豐富度均高于歐洲地區(qū)歐洲狍種群以及亞洲其他地區(qū)的西伯利亞狍種群。7個種群之間，遺傳多樣性比較接近，未出現(xiàn)遺傳多樣性較低的情況。選取的10個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性分析也表明7個種群的多態(tài)信息含量水平均較高，多態(tài)性豐富。這些數(shù)據(jù)表明，研究區(qū)域內(nèi)的西伯利亞狍種群具有良好的選育和遺傳潛力，是可以進(jìn)行持續(xù)利用的種質(zhì)資源。因此，本研究為以后進(jìn)行西伯利亞狍種群的合理利用、種群保護(hù)提供了一定的理論依據(jù)，同時也為下一步分析西伯利亞狍作為獵物種群，對東北虎、東北豹種群的保護(hù)和恢復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝國家林業(yè)局野生動物與自然保護(hù)區(qū)管理司“虎、東北豹資源調(diào)查技術(shù)研究”和“東北虎、東北豹種群及棲息地調(diào)查評估標(biāo)準(zhǔn)制定及信息匯總”項目的資助。感謝實驗室?guī)熜?、師姐、師弟和師妹給予的幫助。本研究還得到了浙江大學(xué)方盛國教授及其科研團(tuán)隊的指導(dǎo)。實驗在野生動物資源學(xué)院綜合實驗室完成，得到了羅理楊老師的指導(dǎo)。野外采樣工作得到了項目區(qū)各林業(yè)局和保護(hù)區(qū)工作人員的支持和幫助，在這里一同表示感謝。