鄭佳琳，黃小紅，武 昕，黃小瓊，曾素丹，鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東佛山528248）

骨髓抑制是化療最常見的毒副作用之一，不但影響了治療的連續(xù)性，而且嚴(yán)重的骨髓抑制可引起明顯的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞減少，導(dǎo)致患者易感染和出血，甚至死亡[1]。從某種意義上來說，對骨髓抑制的控制是化療成功與否的關(guān)鍵[2]。為了最大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞，同時又能最大程度減輕化療藥物的毒性作用，快速地恢復(fù)機(jī)體的造血功能，造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)已開始越來越多地用于臨床[3]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增能力強，免疫原性低，多向分化潛能在體內(nèi)外都已得到充分證明，在移植治療肝損傷、心肌梗死、脊髓損傷等產(chǎn)生了良好的治療效果[4]。本研究通過建立小鼠骨髓移植模型，探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)嚴(yán)重骨髓損傷小鼠造血功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心 〔SCXK （粵）2013-0002〕。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級動物房〔SYXK（粵）2013-0002〕。 夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗結(jié)果的可靠性。自由進(jìn)食飲水，飼料和動物飼養(yǎng)條件：5只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40～70%，采用10h：14h晝飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺（CTX）、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（rhG–CSF），細(xì)胞周期試劑盒；JEA3001系列電子天平、BCD-5000全自動血液細(xì)胞分析儀、BD AccuriC6流式細(xì)胞儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

體外大量培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇處于對數(shù)生長期及狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行給藥治療。

1.4 動物造模

將檢疫合格的40只雄性BALB/c小鼠按照體重隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，每組10只。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，1 次/d，連續(xù) 7 d，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生骨髓抑制。

1.5 動物給藥

末次給予環(huán)磷酰胺次日，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組一次性尾靜脈注射1.0×107個小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；陽性對照組小鼠腹腔注射 125 μg·kg-1·d-1 rhG–CSF，空白對照組和模型對照組灌胃給予等量純凈水，每天1次，連續(xù)給藥7天。

1.6 外周血血常規(guī)檢查

分別于實驗第8，10，14天，取尾靜脈血20 μL置于130 μL肝素抗凝稀釋液中，充分混勻。用Mek-7222k型全自動血球計數(shù)儀檢測小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板的變化。

1.7 骨髓有核細(xì)胞懸液的制備及有核細(xì)胞計數(shù)

實驗第14天頸椎脫臼處死各組小鼠，取出右側(cè)股骨，除凈軟組織，用6號針頭以1 mL PBS沖出骨髓細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾后裂解紅細(xì)胞，將單個骨髓細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，去上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次，棄上清，用 PBS定容至5 mL。按白細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計數(shù)。并計算絕對數(shù)量。

1.8 骨髓有核細(xì)胞細(xì)胞周期的分析測定

取上述制備好的骨髓單核細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，加入70%預(yù)冷乙醇固定打散細(xì)胞，4℃固定過夜，用 PBS將上述細(xì)胞洗 2次，加 100 μL PBS 混勻，加 PI染液（4℃，避光 30 min），以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化，一般計數(shù)1～2萬個細(xì)胞，結(jié)果用軟件FlowJo7.6分析細(xì)胞周期。結(jié)果以細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分率表示，并按以下公式計算細(xì)胞增殖指數(shù) (proliferation index,PI)：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.9 骨髓組織病理學(xué)檢查

取小鼠左側(cè)股骨固定、脫鈣，石蠟切片蘇木精-伊紅染色，觀察股骨骨髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.10 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對骨髓抑制小鼠外周血象的影響

與空白對照組比較，實驗第8天，其余各組小鼠外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均顯著降低 （P＜0.05），證明造模成功。實驗第14天，模型組小鼠的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均有所升高，但仍均顯著低于空白對照組（P＜0.05）。

與模型對照組比較，實驗第10天（即治療第3天），陽性對照組和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均開始升高，到實驗第14天（即治療第7天），逐漸恢復(fù)正常水平；其中，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組白細(xì)胞數(shù)目與血紅蛋白在實驗第10天，白細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積值在實驗14天均顯著升高（P＜0.05）；結(jié)果見表1和表2。

表1 各組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的比較（±s，n=10，♂）

表1 各組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別白細(xì)胞數(shù)目（×109/L） 淋巴細(xì)胞數(shù)目（×109/L） 紅細(xì)胞數(shù)目（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對照組 7.7±0.6 9.3±0.5 10.4±1.4 6.83±1.37 7.10±1.66 7.11±1.80 9.1±0.3 9.1±0.9 8.9±0.9模型對照組 1.9±0.5* 2.2±0.7* 3.9±0.9* 2.34±0.80* 3.56±0.83* 4.91±1.25* 6.5±0.6* 7.3±0.9* 7.8±1.1陽性對照組 2.2±0.5* 5.0±0.6△ 6.7±0.8△ 2.93±0.92*4.85±1.08 6.05±1.18 6.9±0.8* 7.8±0.7 8.7±1.2小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 2.2±0.7* 5.6±1.0△ 6.8±0.7△ 2.64±0.71* 4.88±0.74 6.02±0.94 6.8±0.9* 7.5±1.0 8.3±1.0

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

血小板數(shù)目（×109/L） 血紅蛋白（×109/L） 紅細(xì)胞壓積（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對照組 921±102 930±75 973±163 150±3 161±17 154±19 42.3±1.3 41.0±4.6 43.3±3.8模型對照組 536±116* 652±105* 748±148* 86±10* 95±17* 101±16* 33.7±3.6* 35.3±2.0* 38.0±3.0*陽性對照組 513±99* 762±1671) 900±86 89±15* 108±14 126±22△ 32.8±3.2* 39.0±3.3 42.5±4.0組別小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 549±154* 798±106 907±101 94±14* 120±20△ 133±17 △ 30.3±4.7* 39.4±4.9 43.1±3.7△

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對骨髓抑制小鼠骨髓有核細(xì)胞的影響

與空白對照組比較，模型對照組小鼠骨髓有核細(xì)胞（BMC）數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，陽性對照組和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組均可以顯增加骨髓抑制小鼠的骨髓BMC數(shù)量（P＜0.05）；結(jié)果見表3。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞周期變化的影響

與空白對照組比較，造模后骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期出現(xiàn)了停滯的狀態(tài)，模型組小鼠G0/G1期細(xì)胞顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞均顯著減少，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）顯著降低（P＜0.05）。

與模型對照組比較，陽性對照組和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組均能解除 G0/G1期細(xì)胞阻滯，促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，使G2/M期細(xì)胞增加，增加骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞的增殖指數(shù)（P＜0.05）；結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞周期的比較（±s，n=10，♂）

表3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞周期的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 骨髓有核細(xì)胞數(shù)（×106/L） G0/G1（%） S（%） G2/M（%） PI（%）空白對照組 15.33±2.00 54.76±2.85 34.22±2.29 11.32±1.08 45.41±1.96模型對照組 5.48±1.13* 72.48±1.88* 22.55±1.77* 6.05±0.75* 28.28±1.75*陽性對照組 11.68±1.06△ 65.55±2.45△ 24.12±2.60 8.27±1.06△ 33.05±2.53△小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 12.26±0.97△ 65.00±2.46△ 25.06±1.37 8.44±0.47△ 34.02±1.52△

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對骨髓抑制小鼠骨髓組織病理學(xué)的影響

各組小鼠骨髓病理切片見圖A～D?？瞻讓φ战M小鼠骨髓造血細(xì)胞比例正常且分布均勻，未見明顯的脂肪組織（圖A）；模型對照組小鼠骨髓腔充滿脂肪組織，出現(xiàn)大量空白區(qū)，，造血細(xì)胞殘余少量，成熟紅細(xì)胞增多（圖B）；陽性對照組（圖C）、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組（圖D）小鼠的骨髓抑制均有所改善，病理切片可見脂肪細(xì)胞明顯減少，造血細(xì)胞增生且比例未見異常，成熟紅細(xì)胞數(shù)量正常。

圖A～D各組小鼠骨髓病理切片HE染色（×400）

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物之一，主要用于血液系統(tǒng)及各種實體腫瘤的治療[5]。但是由于環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物[5]，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過程中也會影響正常細(xì)胞的增殖與分化，從而引起骨髓抑制等諸多不良反應(yīng)。大劑量連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺，常用于動物實驗中制備骨髓抑制模型。

骨髓間充干細(xì)胞具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴(kuò)增，在細(xì)胞治療、基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來證實，骨髓間充干細(xì)胞除具有促進(jìn)造血干細(xì)胞移植后造血重建外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，防治移植物抗宿主病[6]。

本研究觀察了小鼠骨髓間充干細(xì)胞對小鼠骨髓抑制模型的造血功能的影響，結(jié)果表明，與模型對照組比較，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，G0/G1期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例升高，提高細(xì)胞增殖率和造血細(xì)胞比例的作用。以上結(jié)果提示，小鼠骨髓間充干細(xì)胞能夠拮抗環(huán)磷酰胺對骨髓細(xì)胞的抑制作用，提高骨髓細(xì)胞的增殖和外周血象，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，有利于緩解骨髓抑制病征。