葛云飛 康子悅 沈 蒙 王維浩,2 曹龍奎,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)

高粱作為我國第五大糧食作物，因其高產(chǎn)性和高抗逆性及其在制糖、釀酒和飼料等產(chǎn)業(yè)方面用途廣泛而被大量種植[1]。但由于高粱的適口性較差口感較粗糙不易被消費(fèi)者所接受，因此主要將其應(yīng)用于飼料行業(yè)中，使高粱價(jià)值并沒有得到充分利用。自然發(fā)酵谷物是我國生產(chǎn)食品的特殊方法，因其改善口感、增加風(fēng)味、提高營養(yǎng)成分而被大眾廣泛認(rèn)同，目前我國發(fā)酵領(lǐng)域主要集中在發(fā)酵小米[2]、發(fā)酵玉米[3]、發(fā)酵大米[4]、發(fā)酵黃米[5]。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵處理可提高谷物的抗老化性能、改善產(chǎn)品的流變性并使淀粉凝膠硬度下降。目前學(xué)者研究發(fā)酵高粱主要集中在高粱的產(chǎn)品研發(fā)、菌種鑒定及其分離純化[6]，但對(duì)自然發(fā)酵對(duì)高粱理化性質(zhì)的影響研究較少。淀粉為高粱中主要的碳水化合物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為60%～70%，高者可達(dá)80%左右，因此淀粉的性質(zhì)決定了高粱產(chǎn)品的加工性能和食用品質(zhì)，其中淀粉的糊化、老化性質(zhì)對(duì)其產(chǎn)品的研究開發(fā)有較大影響[7]。為開闊高粱淀粉的應(yīng)用領(lǐng)域，本實(shí)驗(yàn)將以高粱為發(fā)酵對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行自然發(fā)酵0～15 d，觀察不同發(fā)酵時(shí)期高粱淀粉理化性質(zhì)的變化，以實(shí)現(xiàn)高粱發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)，為高粱淀粉的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高粱，山東臨沂R高粱；鹽酸(分析純)、氧化鈉(分析純)、碘及碘化鉀蒸餾水、無水乙醇、乙酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RVA4500型快速黏度分析儀：瑞典波通儀器公司；DSC1型差示掃描量熱儀：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TAQ2000國產(chǎn)高壓不銹鋼坩堝：上海瑾恒儀器有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；HJ25-SCT-02型索氏提取器：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BUCHI-K370型全自動(dòng)凱氏定氮儀：瑞士BUCHI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 自然發(fā)酵高粱

取高粱150 g，經(jīng)蒸餾水水洗3次，加入一定量的蒸餾水(料液比1∶2 g/mL)、3%葡萄糖，在30 ℃條件下進(jìn)行自然發(fā)酵0～15 d。

1.3.2 自然發(fā)酵高粱粉化學(xué)成分含量的測(cè)定

1.3.2.1 粗脂肪含量的測(cè)定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉2 g，裝入濾紙筒,然后放入抽提器內(nèi)。把抽提器與已知恒重的干燥抽提瓶聯(lián)接于冷凝器上，由冷凝器上口加入石油醚50 mL，接通冷凝水，將水浴鍋的溫度調(diào)到65 ℃左右開始蒸餾，控制虹吸次數(shù)為20次/h左右。蒸餾6 h后，取出濾紙筒，回收石油醚，抽提瓶于105 ℃干燥箱中烘干l h后稱重。

1.3.2.2 粗蛋白含量的測(cè)定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉1 g，方法為凱氏定氮法，具體參照GB 5009.5—2010[8]中的蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。

1.3.2.3 灰分的測(cè)定

精確稱取自然發(fā)酵0～15 d的高粱粉2 g于已知恒重的坩鍋內(nèi)，將蓋稍錯(cuò)開約0.5 cm，置于電爐上灼燒完全碳化至無煙為止，再置于馬福爐中，在550 ℃灼燒2～3 h至試樣變成白色或灰白色，取出于干燥器內(nèi)冷卻稱重。然后再復(fù)灼燒0.5 h，取出冷卻稱重，直至前后兩次質(zhì)量差不超過0.2 mg為恒重。如果最后一次質(zhì)量增大，則以前一次質(zhì)量計(jì)算，精確至0.000 1 g，結(jié)果計(jì)算到小數(shù)點(diǎn)后第二位，雙實(shí)驗(yàn)許可誤差不超過0.03%，取平均值。

1.3.3 自然發(fā)酵高粱淀粉的制備

發(fā)酵后的高粱進(jìn)行水洗，于35 ℃下烘干。將干磨后過80目篩的高粱粉于1/3 g/mL，質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL的NaOH溶液中浸提3 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，除去沉淀中上層黃褐色物質(zhì)，連續(xù)水洗四次、離心直至淀粉漿呈白色為止。用1 mol/LHCl調(diào)淀粉漿至pH為7.0，4 000 r/min離心10 min、30℃干燥，過80目篩備用[9]。

1.3.4 發(fā)酵高粱淀粉保水力和溶解度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品于50 mL試管中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的淀粉乳，分別在40 ℃和80 ℃下混勻并加熱30 min，快速冷卻，然后在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min分離上清液和沉淀物，測(cè)定沉淀質(zhì)量和上清液干物質(zhì)質(zhì)量(105 ℃烘至恒重)。溶解度為上清液干物質(zhì)質(zhì)量與樣品干基質(zhì)量百分比，保水力為沉淀質(zhì)量同樣品干基質(zhì)量減去上清液干物質(zhì)質(zhì)量的百分比。

1.3.5 發(fā)酵高粱淀粉透明度的測(cè)定

確稱樣品1.000 g，配制質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的淀粉乳，置于沸水浴中糊化30 min后，冷卻至室溫，在620 nm波長處測(cè)定其透明度。以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.3.6 發(fā)酵高粱直鏈淀粉含量的測(cè)定

1.3.6.1 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取0.1 g直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，分別加入無水乙醇1 mL，1.0 moL/L NaOH9 mL，搖勻于沸水浴中加熱10 min，冷卻后定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg/mL的直鏈/支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。取5個(gè)100 mL的容量瓶分別加入上述直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液0、0.25、0.5、1、1.5 mL，再依次加入支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品5、4.75、4.5、4、3.5 mL，另空白樣為0.09 moL/LNaOH 5 mL，依次加入1 mL乙酸溶液(1 moL/mL)和1 mL碘試劑(2%碘化鉀和0.2%碘)用水定容至25 mL，顯色10 min，于620 nm處比色并記錄吸光度值。以直鏈淀粉質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 發(fā)酵樣品直鏈淀粉含量的測(cè)定

稱取發(fā)酵后的淀粉樣品0.1 g于燒杯中，方法同上，冷卻后定容至100 mL容量瓶中。依次加入乙酸溶液和碘試劑各1 mL用水定容至50 mL，顯色10 min，于620nm處比色并記錄吸光度值。

1.3.7 發(fā)酵高粱淀粉老化性質(zhì)的測(cè)定

稱取3.50 0 g(干基)發(fā)酵及未發(fā)酵高粱淀粉于鋁筒中，加蒸餾水25 mL，35 ℃保溫3 min，設(shè)定轉(zhuǎn)速率6 ℃/min加熱到95 ℃，保溫5 min，以6 ℃/min的轉(zhuǎn)速率降溫到50 ℃，用儀器配套的軟件分析得到曲線[10]。

1.3.8 發(fā)酵高粱淀粉糊化特性的測(cè)定

稱取3.0 mg(干基)發(fā)酵及未發(fā)酵高粱淀粉于坩堝中，加入7 μL蒸餾水，用壓片器反復(fù)壓3～4次至坩堝邊緣密封完好。室溫下均衡12 h，在N2流量為150 mL/min、壓力0.1 MPa、速度升溫5 ℃/min[11]的條件下測(cè)定不同樣品的糊化特性曲線。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel、Spss軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin軟件進(jìn)行繪圖處理，各數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵高粱粉化學(xué)成分含量的測(cè)定

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，高粱粉的粗脂肪、蛋白及灰分均呈下降的趨勢(shì)(圖1)：其原因是自然發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸和酶類物質(zhì)使與淀粉結(jié)合的蛋白質(zhì)、油脂發(fā)生降解，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)被降解成小分子的肽或者氨基酸更易溶出；而脂肪降解為游離脂肪酸，游離脂肪酸會(huì)進(jìn)一步降解為小分子的醛、酮物質(zhì)，因此伴隨著發(fā)酵的進(jìn)行，會(huì)有不良?xì)馕渡桑挥捎谟椭偷鞍踪|(zhì)的降解，使原來與蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉結(jié)合形成的結(jié)合物中所包埋的礦物質(zhì)更易釋放出來，從而使發(fā)酵后大米粉的灰分含量降低。

圖1 自然發(fā)酵對(duì)高粱粉化學(xué)成分含量的影響

2.2 自然發(fā)酵對(duì)高粱淀粉保水力和溶解度的影響

不同發(fā)酵時(shí)間下的高粱淀粉的保水力與溶解度變化趨勢(shì)如圖2所示：在80 ℃時(shí)發(fā)酵高粱淀粉的保水力及溶解度均較高于40 ℃。在較高溫度下，淀粉的保水力較高，其原因是在一定的糊化溫度下，淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，淀粉吸水能力增強(qiáng)，保水力增加，淀粉的膨脹力較大，因此DSC(差示掃描量熱儀)的糊化溫度較低、糊化速度較快[12]。在發(fā)酵前期淀粉的保水力及溶解度因發(fā)酵底物有機(jī)酸、酶等對(duì)直鏈淀粉的降解作用而有小幅度的降低，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長支鏈淀粉被水解成小分子的糖及短直鏈淀粉，使直鏈淀粉的比例相對(duì)增加，保水力、溶解度也隨之增加[13]，在發(fā)酵后期淀粉被充分降解成為小分子的糖，所以保水力及溶解度均呈降低趨勢(shì)。

圖2 自然發(fā)酵對(duì)淀粉保水力和溶解度的影響

2.3 自然發(fā)酵對(duì)高粱淀粉透明度的影響

透明度與淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的緊密程度及糊化特性有一定的關(guān)聯(lián)，其大小直接影響到淀粉基產(chǎn)品的外觀及用途，糊化后的淀粉分子重新聚合排列程度對(duì)淀粉的透明度影響較大[14]，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)高粱淀粉透明度的影響結(jié)果如圖3所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，淀粉的透明度有降低隨后稍有增加，在一定發(fā)酵時(shí)間下，淀粉糊化使其顆粒結(jié)構(gòu)的締合程度減弱，直鏈淀粉分子從顆粒中析出，增加了淀粉分子的重排及相互締合的機(jī)會(huì)，使高粱淀粉的透明度下降，由于發(fā)酵使淀粉中的支鏈淀粉的長鏈部分發(fā)生裂解或者脫支，直鏈淀粉的比例相對(duì)增加，因此淀粉的透明度降低。

圖3 自然發(fā)酵對(duì)淀粉透明度影響

2.4 自然發(fā)酵對(duì)高粱直鏈淀粉含量的影響

2.4.1 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在波長620 nm條件下測(cè)定溶液吸光度值，以直鏈淀粉質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3，y=0.088 4x+0.657 4，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，說明直鏈淀粉含量與吸光光度值有著良好的線性關(guān)系。

圖4 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 自然發(fā)酵對(duì)高粱直鏈淀粉含量的影響

高粱中直鏈淀粉的含量是影響淀粉理化性質(zhì)的主要因素[15]，即直鏈淀粉有著很強(qiáng)的老化聚合趨勢(shì)，因此將未發(fā)酵和不同發(fā)酵時(shí)期的高粱淀粉進(jìn)行直鏈淀粉含量的測(cè)定，經(jīng)平行3次測(cè)定，其結(jié)果如圖5所示。

淀粉中直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～25%[16]，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵樣品中直鏈淀粉的含量先降低后增加，其發(fā)生原因可能是發(fā)酵初期微生物進(jìn)行生長繁殖，營養(yǎng)物質(zhì)大量溶出，直鏈淀粉發(fā)生部分外溶現(xiàn)象，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長使部分支鏈淀粉發(fā)生一定程度的降解、脫支，直鏈淀粉含量出現(xiàn)明顯小幅度的回升趨勢(shì)，且略高于未發(fā)酵樣品直鏈淀粉含量。而袁美蘭等[17]對(duì)自然發(fā)酵玉米直鏈淀粉含量的變化結(jié)果表明發(fā)酵使直鏈淀粉變化趨勢(shì)不顯著，兩結(jié)果不同的原因可能是原料的不同或隨著發(fā)酵時(shí)間的延長高粱中的脂肪、蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的降解，使直鏈淀粉含量升高。

圖5 自然發(fā)酵對(duì)高粱直鏈淀粉含量的影響

2.5 自然發(fā)酵對(duì)高粱淀粉老化性質(zhì)的影響

高粱在一定溫度、加糖量的條件下進(jìn)行自然發(fā)酵并與未發(fā)酵高粱淀粉進(jìn)行對(duì)比，其RVA特征值有明顯變化(表1)，其中峰值黏度、衰減值隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，最終黏度與回生值均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而出現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，此結(jié)果與袁美蘭[18]等人所研究結(jié)果相同。

淀粉是以葡萄糖聚合物的形式存在，高粱中的蛋白質(zhì)將淀粉包裹起來使淀粉吸水膨脹受到一定程度的抑制，發(fā)酵可使蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生一定程度的降解，淀粉吸水膨脹使其體積迅速增大，故峰值黏度增加。衰減值反應(yīng)了淀粉顆粒在進(jìn)行加熱處理時(shí)抗剪切力而維持分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性能力的大小，衰減值越大代表淀粉顆粒的穩(wěn)定性越差。通過Camargo等[19]、Chang等[20]、Han等[21]研究可知支鏈淀粉的長鏈含量與衰減值呈高程度的正相關(guān)，其變化趨勢(shì)發(fā)生原因可能是發(fā)酵產(chǎn)生的酶類物質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)的降解程度逐漸趨于穩(wěn)定，使淀粉分子穩(wěn)定性增強(qiáng)，所以衰減值的變化為上升趨勢(shì)。最終黏度與回生值均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而出現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，最終黏度是對(duì)淀粉糊在冷卻過程中在低剪切力作用下的穩(wěn)定程度的衡量，回生值反應(yīng)淀粉的老化能力，即膨脹前期溶出的直鏈淀粉分子相互交聯(lián)結(jié)合能力的大小。淀粉的老化性質(zhì)與直連淀粉的含量及支鏈鏈長的分布情況有關(guān)[22]，其中回生值降低的原因可能是短期發(fā)酵使直鏈淀粉分子的聚合程度降低，淀粉分子老化能力減小，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵底物酶及酸的積累使支鏈淀粉的長鏈部分水解為短鏈或直鏈淀粉，因此發(fā)酵后期回生值出現(xiàn)回升的趨勢(shì)。

2.6 自然發(fā)酵對(duì)高粱淀粉糊化性質(zhì)的影響

通過淀粉的熱特征參數(shù)，能夠推斷出淀粉分子的結(jié)構(gòu)變化，其中糊化溫度是結(jié)晶結(jié)構(gòu)的定性指標(biāo)，糊化焓是有序結(jié)構(gòu)的定量指標(biāo)，淀粉在發(fā)生糊化反應(yīng)時(shí)，其中一些雙螺旋堆積的有序結(jié)構(gòu)在高于糊化溫度時(shí)，發(fā)生不可逆膨脹現(xiàn)象，失去結(jié)晶結(jié)構(gòu)[23]。表2表示淀粉的熱特征值隨發(fā)酵時(shí)間的延長所發(fā)生的變化，其中糊化溫度隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈先降低后增加的趨勢(shì)，峰值溫度變化幅度較小，而熱晗值的大小隨時(shí)間的增加而呈先增加后降低的趨勢(shì)。

高粱中的蛋白質(zhì)以蛋白體的形式存在淀粉顆粒中，使淀粉分子不能充分吸水膨脹，而發(fā)酵過程能有效的使部分蛋白質(zhì)分解并析出，降低蛋白質(zhì)對(duì)淀粉的束縛作用，加速淀粉的水化作用、促進(jìn)糊化反應(yīng)，提高淀粉分子的糊化速度，降低糊化溫度[24]，此外發(fā)酵能破壞淀粉的非結(jié)晶區(qū)域有效的減少脂類物質(zhì)降低其與直鏈淀粉分子形成絡(luò)合物的概率，并由于非結(jié)晶區(qū)域的破壞，水分子更易滲透進(jìn)入，使淀粉分子的糊化溫度降低。糊化焓的變化趨勢(shì)與糊化溫度呈負(fù)相關(guān)，其中發(fā)酵淀粉的熱晗值較未發(fā)酵最高降低11.31 J·g-1、增加34.42 J·g-1，其直接原因是發(fā)酵破壞了淀粉的非結(jié)晶區(qū)域，使淀粉分子水解而溶出，造成結(jié)晶結(jié)構(gòu)的相對(duì)比例增加，糊化焓上升。

表1 自然發(fā)酵對(duì)淀粉老化性質(zhì)的影響

表2 自然發(fā)酵對(duì)淀粉糊化性質(zhì)的影響

3 結(jié)論

通過將高粱進(jìn)行自然發(fā)酵使淀粉的糊化溫度降低，有利于高粱淀粉的糊化，而回生值在發(fā)酵前期一定程度的降低，較未發(fā)酵降低783 mPa·s，使高粱的抗老化性能得到大幅度的提高，使最后淀粉凝膠質(zhì)地柔軟，彈性較小適合生產(chǎn)抗老化產(chǎn)品如饅頭、面包等產(chǎn)品，在發(fā)酵后期淀粉的回生值高于未發(fā)酵樣品，此時(shí)較適合生產(chǎn)如粉絲等產(chǎn)品。通過將高粱進(jìn)行發(fā)酵處理擴(kuò)大了高粱的應(yīng)用范圍，充分利用其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開闊了高粱淀粉的應(yīng)用領(lǐng)域，該實(shí)驗(yàn)為發(fā)酵高粱的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步的工業(yè)化設(shè)計(jì)提供數(shù)據(jù)支持。