柯丹霞，彭昆鵬，夏遠君，朱玉瑩，張丹丹

(信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院，河南 信陽 464000)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物響應(yīng)逆境脅迫信號途徑中起著重要作用[1]。目前，大量研究報道WRKY類轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。玉米(Zeamays)ZmWRKY25、45、55、67基因在鹽堿脅迫下均呈上調(diào)表達，ZmWRKY62基因呈下調(diào)表達，它們可能以不同方式參與玉米對鹽脅迫的響應(yīng)[2-5]。番茄(Solanumlycopersicum)SlWRKY39基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達，其過量表達增加了植株中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量，抑制了丙二醛的合成，誘導(dǎo)了脅迫相關(guān)基因SlRD22和SlDREB2A的表達，從而增強了番茄植株對鹽害的抗性[6]。棉花(Gossypiumhirsutum)GhWRKY41基因受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，過表達該基因顯著提髙了轉(zhuǎn)基因棉花在高鹽條件下的發(fā)芽率，提高了轉(zhuǎn)基因棉花對鹽脅迫的耐受性[7]。過表達棉花GhWRKY39-1提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[8]。棉花GhWRKY11[9]、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)HbWRKY75[10]、巨桉(Eucalyptusgrandis)EgrWRKY70[11]、辣椒(Capsicumannuum)CaWRKY13[12]以及茶樹(Camelliasinensis)CsWRKY57[13]等WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因在高鹽脅迫下均呈現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)表達，推測這些基因可能參與鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)與調(diào)控。

關(guān)于WRKY類轉(zhuǎn)錄因子在牧草抗逆性改良方面的研究，近年來只在紫花苜蓿(Medicagosativa)中有少量報道。前人將野生大豆(Glycinesoja)GsWRKY20基因?qū)攵箍颇敛葑匣ㄜ俎Ｖ?，發(fā)現(xiàn)過表達該基因不僅可以提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性，還能提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐旱性[14]。最新的研究將野生大豆GsWRKY15基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，發(fā)現(xiàn)過表達GsWRKY15基因的紫花苜蓿在堿脅迫下生長狀態(tài)更好，相對質(zhì)膜透性和丙二醛含量顯著降低，而葉綠素含量顯著升高，紫花苜蓿的耐堿能力顯著增強[15]。

百脈根(Lotusjaponicus)作為一種優(yōu)良的豆科牧草，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。因其固氮效率高，細胞再生性能好，遺傳轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)勢，已經(jīng)成為研究共生固氮機理[16-21]、基因異位表達[22-23]等的理想材料。雖然百脈根具有抗旱和耐鹽堿的特性，但只適宜在輕度干旱和輕度鹽堿的土地上種植，在中、重度鹽漬化及干旱環(huán)境中種植，植株生長受到嚴重限制。Song等[24]率先在Williams 82大豆(Glycinemax)基因組中鑒定到176個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子，RNA-Seq技術(shù)篩選出12個受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因。Yu等[25]在大豆基因組中鑒定到188個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選出66個受鹽脅迫影響的基因，經(jīng)qRT-PCR驗證，獲得35個受鹽脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達的基因和19個受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因。將栽培大豆WRKY類鹽脅迫響應(yīng)基因轉(zhuǎn)入百脈根，在獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因百脈根新材料的同時，在百脈根中揭示該基因的抗鹽機理，此類研究目前未見報道。

本研究克隆得到1個受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達的大豆WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因GmWRKY6。構(gòu)建由強組成型啟動子CaMV35S調(diào)控的植物過表達載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法對百脈根進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR、RT-PCR檢測獲得過表達GmWRKY6基因的百脈根陽性植株。對其中的3個轉(zhuǎn)基因株系進行抗鹽試驗，初步確定GmWRKY6基因在鹽脅迫應(yīng)答中的功能，為進一步闡明GmWRKY6基因在鹽脅迫應(yīng)答調(diào)控中的作用機制奠定了重要的理論基礎(chǔ)。本研究不僅為大豆耐鹽基因工程改良提供了新的候選基因，而且對于培育耐鹽百脈根新品種，增強其在鹽堿地區(qū)的生長能力，充分開發(fā)利用鹽堿化土地資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

大豆測序品種Williams 82種子由中國科學(xué)院東北地理生態(tài)研究所大豆研究室提供；百脈根MG-20種子、改造的植物表達載體p1302G(攜帶有GUS標簽)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室根瘤菌分子研究室提供。2016年7月，大豆種子經(jīng)表面消毒后，置于潤濕濾紙上待萌發(fā)，溫度28 ℃，18 h光照，6 h黑暗。4～5 d后移入1/2 Hoagland培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件不變。待幼苗長出第1片復(fù)葉時開始鹽脅迫處理。將實驗組幼苗移入含200 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland培養(yǎng)液中，分別取鹽處理后0、2、6和24 h大豆根尖組織，對照組幼苗不經(jīng)鹽脅迫處理，與實驗組在相同時間取樣，樣品液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。處理組和對照組每組8棵苗，并設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 GmWRKY6基因的克隆和植物表達載體的構(gòu)建

抽提大豆根組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN公司)說明獲得cDNA 第一鏈。根據(jù)https://www.soybase.org/search/網(wǎng)站公布的大豆Glyma.15g110300.1基因序列設(shè)計引物F-OX(5′-GGAATTCATGGACAAAGGATGG-3′)和R-OX(5′-TCCCCCGGGTCAGTTTC CTGAA AAGC-3′)。下劃線堿基分別為上游和下游酶切位點EcoRⅠ和SmaⅠ。PCR擴增目的片段，連接T載體測序驗證后插入改造過的植物過表達載體p1302G(Gus基因作為篩選標記基因)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p1302G-GmWRKY6。采用凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中備用。

1.3 GmWRKY6基因的表達分析

從已公布的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(https://www.soybase.org/search/)中獲取GmWRKY6基因的時空表達數(shù)據(jù)，包括不同組織或者同一組織在不同時期的表達情況，利用Excel表繪圖分析GmWRKY6基因的時空表達特征。此外，利用Primer 5.0軟件設(shè)計1對GmWRKY6特異性引物F-rt(5′-ATGGACAAAGGATGG-3′)和R-rt(5′-AACTTCACCGACAAC-3′)，分別提取1.1中鹽脅迫處理和對照樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈后，利用熒光定量PCR檢測GmWRKY6基因表達量。以大豆肌動蛋白11(ACT11)為內(nèi)參基因，引物為F-ACT11(5′-ATTTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′)和R-ACT11(5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′)。根據(jù)相對定量法(2-ΔΔCT)公式計算結(jié)果。設(shè)置3次獨立生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。

1.4 轉(zhuǎn)GmWRKY6基因百脈根的獲得

參照《LotusjaponicusHandbook》[26]所述方法，用1.2中制備好的含有GmWRKY6基因的農(nóng)桿菌菌懸液侵染百脈根子葉節(jié)，侵染后的外植體經(jīng)共培養(yǎng)-再生-篩選-芽誘導(dǎo)-芽生長-芽伸長-根誘導(dǎo)-根伸長等步驟后，獲得15株抗性苗，將其移栽到盆缽中保鮮膜覆蓋煉苗4～5 d，18 h光照，6 h黑暗，22 ℃培養(yǎng)，每天澆灌1/8 Hoagland 營養(yǎng)液1次。

提取15株抗性苗葉片總DNA，PCR擴增Gus標簽基因，引物為F-Gus(5′-GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3′)和R-Gus(5′-CGGCGAAATTCCATACCTG-3′)。經(jīng)PCR檢測的陽性苗，進一步進行RT-PCR檢測。提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用1.2中引物擴增GmWRKY6基因。以百脈根GPDH為內(nèi)參基因，引物為F-GPDH(5′-GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT-3′)和R-GPDH(5′-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3′)。RT-PCR檢測為陽性的7株百脈根植株，在光照培養(yǎng)箱中以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，待開花結(jié)莢后，收集T0代種子并作好記錄。

1.5 轉(zhuǎn)基因百脈根的鹽脅迫處理

將1.4中收集的T0代轉(zhuǎn)基因百脈根種子與野生型種子表面消毒，移入潤濕濾紙上待萌發(fā)。1周后將幼苗種入含基質(zhì)盆缽中，每盆5顆苗，18 h光照，6 h黑暗，22 ℃培養(yǎng)，每天澆灌1/8 Hoagland 營養(yǎng)液1次。3周后選取生長狀態(tài)良好，長勢相似的植株，平均分成3組，每組6盆共30株苗進行鹽脅迫處理，分別用含有0、100和200 mmol·L-1NaCl的1/8 Hoagland營養(yǎng)液每天澆灌1次，2周后分析轉(zhuǎn)基因和野生型百脈根的抗鹽表型，測量株高，根長并進行相關(guān)生理指標測定。

1.6 抗鹽相關(guān)生理指標的檢測

采用水合茚三酮法測定脯氨酸含量[14]；采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量[22]；采用80%丙酮抽提比色法測定葉片中葉綠素含量[22]；利用電導(dǎo)率儀檢測葉片的相對電導(dǎo)率，測定相對質(zhì)膜透性[22]。利用火焰分光光度計測定葉片中Na+和K+含量[14]。所有指標測定均設(shè)置3次重復(fù)，取平均值。

1.7 統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0軟件檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

圖1 GmWRKY6基因的PCR擴增(A)和重組質(zhì)粒p1302G-GmWRKY6的酶切鑒定(B) Fig.1 PCR amplification of GmWRKY6 gene (A) and enzyme digestion of the recombinant plasmid p1302G-GmWRKY6 (B) M: DL2000 DNA marker; 1: GmWRKY6目的片段 Target fragment of GmWRKY6 gene; 2: 重組質(zhì)粒p1302G-GmWRKY6的EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切 Recombinant plasmid p1302G-GmWRKY6 digested with EcoRⅠ and SmaⅠ.

2.1 GmWRKY6基因的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GmWRKY6基因的已知序列設(shè)計引物，以大豆根組織cDNA為模板，通過PCR 擴增得到1條長度為1674 bp 的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1A)。將目的片段插入改造過的植物表達載體p1302G中，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切后獲得大小正確的載體片段和目的片段(圖1B)，將質(zhì)粒送交公司測序。利用凍融法將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中保種備用。

2.2 GmWRKY6蛋白的同源比對及進化樹分析

利用NCBI中的Blastp程序以及DNAMAN軟件，對大豆GmWRKY6氨基酸序列與其他植物中同源蛋白進行多序列比對發(fā)現(xiàn)(圖2)，GmWRKY6基因編碼的氨基酸序列與野生大豆GsWRKY6同源性最高，將該基因命名為GmWRKY6。對GmWRKY6蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析可知，該蛋白包含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，包括N-端高度保守的WRKYGQK七肽及C-端的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)(Cx5Cx23HxH)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)、鋅指結(jié)構(gòu)的類型及WRKY結(jié)構(gòu)域中某些氨基酸差異，將GmWRKY6蛋白歸為第Ⅱ大類b小類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。上述10種WRKY類同源蛋白的進化樹分析結(jié)果表明(圖3)，大豆GmWRKY6與野生大豆GsWRKY6處在同一進化分支上，在進化過程中二者親緣關(guān)系較近。

2.3 GmWRKY6基因的組織表達分析

從已公布的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取GmWRKY6基因在不同組織及不同時期的表達情況，如圖4所示，GmWRKY6基因在根中表達量最高，其次是花、開花后14和10 d莢殼、根瘤、幼葉以及1 cm豆莢，在開花后10、14、21、25、28、35、42 d種子中表達量很低甚至檢測不到GmWRKY6基因的表達。說明GmWRKY6基因的表達在大豆中具有組織特異性，其行使功能的主要部位可能在根中。

圖2 GmWRKY6與其他植物WRKY蛋白的多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of GmWRKY6 and other WRKY proteins

續(xù)圖2 GmWRKY6與其他植物WRKY蛋白的多序列比對Continued Fig.2 Multiple sequence alignment of GmWRKY6 and other WRKY proteins 下劃線部分表示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域 The underlined region indicates WRKY domain；* 部分表示W(wǎng)RKYGQK氨基酸序列 * represents WRKYGQK amino acid sequence；↓ 表示C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的C 和H 殘基 ↓ means C and H residues in C2H2 zinc-finger motif.

圖3 大豆GmWRKY6與其他植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of GmWRKY6 with other plants’ WRKY transcription factors

2.4 GmWRKY6基因的鹽脅迫表達分析

圖4 大豆GmWRKY6基因在不同組織中的表達分析Fig.4 Relative expression levels of GmWRKY6 in different tissues 1: 幼葉 Young leaf；2: 花 Flower; 3:豆莢 Pod (1 cm); 4: 莢殼 Pod shell(開花后10 d 10 days after flower); 5: 莢殼 Pod shell(開花后14 d 14 days after flower); 6: 種子 Seed(開花后10 d 10 days after flower); 7: 種子 Seed(開花后14 d 14 days after flower); 8: 種子 Seed(開花后21 d 21 days after flower); 9: 種子 Seed(開花后25 d 25 days after flower); 10: 種子 Seed(開花后28 d 28 days after flower); 11: 種子 Seed(開花后35 d 35 days after flower); 12: 種子 Seed(開花后42 d 42 days after flower); 13: 根 Root; 14: 根瘤 Nodule.

圖5 大豆GmWRKY6基因在鹽脅迫下的表達分析Fig.5 Expression analysis of GmWRKY6 treated with 200 mmol·L-1 NaCl *：差異顯著(P<0.05) Significant difference (P<0.05); **:差異極顯著(P<0.01) Extremely significant difference (P<0.01); 下同 The same below.

通過Real-time PCR檢測GmWRKY6基因在無鹽脅迫下以及鹽處理后0、2、6和24 h的表達情況，如圖5所示，200 mmol·L-1NaCl處理2 h時，GmWRKY6基因的表達量迅速上升，隨處理時間的延長表達量持續(xù)升高，至6 h 時達到最大值，為脅迫前的22倍，24 h時略有下降，為脅迫前的17倍，而對照組中GmWRKY6基因在4個不同時間的表達量沒有顯著性差異。說明GmWRKY6基因確實是一個受鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子。

2.5 轉(zhuǎn)GmWRKY6基因百脈根的分子生物學(xué)檢測

應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法將植物表達載體p1302G-GmWRKY6導(dǎo)入百脈根，經(jīng)Kana篩選得到15株抗性植株，應(yīng)用Gus標簽基因的特異引物對抗性植株進行PCR 鑒定，在#3～#10這8個轉(zhuǎn)基因植株中檢測到較明顯的目的條帶，#11、#13和#16植株中出現(xiàn)較弱的條帶，只有#12、#14、#15和#17這4個植株中未檢測到目的條帶，說明抗性植株的PCR 陽性率較高，達到了73%，如圖6A所示，共獲得PCR 陽性植株11 株。利用半定量RT-PCR方法檢測部分PCR陽性植株中GmWRKY6基因的表達，在#3～#9這7個轉(zhuǎn)基因植株中均能檢測到GmWRKY6基因的轉(zhuǎn)錄表達，而在野生型對照中未檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄信號(圖6B)。

2.6 轉(zhuǎn)GmWRKY6基因百脈根的耐鹽表型分析

選取RT-PCR陽性植株#4、#6和#7這3個轉(zhuǎn)基因株系進行鹽脅迫處理。將轉(zhuǎn)基因和野生型株系分別用0、100 和200 mmol·L-1NaCl處理2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常條件下，轉(zhuǎn)基因與野生型株系的生長狀態(tài)并無明顯差異，而在100 mmol·L-1NaCl脅迫下，3個轉(zhuǎn)基因株系的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于對照，當(dāng)鹽濃度增加到200 mmol·L-1時，轉(zhuǎn)基因株系仍能正常生長，而野生型株系出現(xiàn)明顯的干枯萎蔫甚至死亡現(xiàn)象(圖7)，說明轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性明顯好于野生型對照。隨后對所有株系的株高與根長進行了測量，隨著鹽濃度的增大，轉(zhuǎn)基因與對照植株的株高與根長都呈下降趨勢，但3個轉(zhuǎn)基因株系的下降幅度均明顯小于對照(圖8)。如在200 mmol·L-1NaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因株系#6的株高是對照株系的1.63倍，轉(zhuǎn)基因株系#4的根長是對照株系的1.54倍。以上證據(jù)表明轉(zhuǎn)GmWRKY6基因百脈根耐鹽能力較強。

圖6 轉(zhuǎn)基因百脈根的分子生物學(xué)檢測Fig.6 Molecular detection of transgenic L. japonicus A： PCR檢測轉(zhuǎn)基因百脈根中GUS基因的表達 Detection of GUS gene expression in transgenic L. japonicus by PCR； B： RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因百脈根中GmWRKY6基因的表達 Detection of GmWRKY6 gene expression in transgenic L. japonicus by RT-PCR; M： DL2000 DNA marker； 1： 條帶大小為600 bp的質(zhì)粒陽性對照 Plasmid positive control with 600 bp size； 2： 野生型對照 Wild type control； #3～#17： 轉(zhuǎn)基因株系 Transgenic plants.

圖7 轉(zhuǎn)基因百脈根抗鹽表型分析Fig.7 Salt stress phenotype analysis of transgenic L. japonicus Wt:野生型株系 Wild type plant. 下同 The same below.

2.7 鹽脅迫相關(guān)生理指標的檢測

脯氨酸作為一種滲透性保護物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細胞質(zhì)內(nèi)滲透勢。從圖9A可知，在無鹽脅迫時，脯氨酸在轉(zhuǎn)基因和野生型株系中的含量基本保持一致。經(jīng)鹽處理后二者的脯氨酸含量均呈上升趨勢，但轉(zhuǎn)基因株系的上升幅度明顯高于對照，在200 mmol·L-1NaCl處理條件下差異極顯著(P<0.01)。說明鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系中的脯氨酸大量積累，保護細胞避免脫水，從而降低膜損傷。

丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，它的含量反映了鹽脅迫對膜氧化損傷程度的大小。圖9B 顯示，隨著鹽濃度的升高，轉(zhuǎn)基因株系和對照的丙二醛含量均呈上升趨勢，但3個轉(zhuǎn)基因株系的增加幅度顯著低于對照(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)基因百脈根降低了高鹽脅迫對膜氧化的損傷程度，耐鹽能力得到了顯著提高。

圖8 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因百脈根株高(A)和根長(B)的影響Fig.8 Changes of shoot height (A) and root length (B) of transgenic L. japonicus under salt stress

圖9 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根的生理指標測定Fig.9 Analysis on physiological characteristics of transgenic L. japonicus under salt stress

從圖9C可知，在無鹽脅迫時，葉綠素在轉(zhuǎn)基因和野生型株系中的含量未見明顯差異。經(jīng)鹽處理后，3個轉(zhuǎn)基因株系和野生型對照的葉綠素含量均迅速下降，但轉(zhuǎn)基因株系的下降幅度低于野生型對照，在200 mmol·L-1NaCl處理條件下，野生型對照的葉綠素含量顯著低于轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)。顯然在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)GmWRKY6基因百脈根株系的葉綠體受傷害程度較小，植株具有更強的光合能力，從而能夠保持更好的生長狀態(tài)。

圖9D表明，隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因和野生型株系的相對質(zhì)膜透性也隨之增加，但轉(zhuǎn)基因植株的增加幅度低于野生型對照，在200 mmol·L-1NaCl處理條件下，野生型對照的相對質(zhì)膜透性顯著高于轉(zhuǎn)基因株系(P<0.01)。說明在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)GmWRKY6基因株系細胞膜所受的損害較輕，質(zhì)膜完整性較好，因此細胞膜具有較強的生理活性，植株表現(xiàn)出較高的耐鹽性。

2.8 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根Na+和K+含量測定

通過測定轉(zhuǎn)基因和對照植株葉片中Na+和K+含量發(fā)現(xiàn)(圖10)，非脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因百脈根葉片內(nèi)Na+和K+含量與野生型之間沒有明顯差異。隨著鹽濃度的增加，3個轉(zhuǎn)基因株系和野生型對照葉片中Na+含量均隨之升高，與之相反的是，K+含量均隨之降低。在同一鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因株系葉片中Na+含量顯著低于對照株系，K+含量顯著高于對照株系。在100 mmol·L-1NaCl處理條件下二者差異顯著(P<0.05)，在200 mmol·L-1NaCl處理條件下二者差異極顯著(P<0.01)。說明轉(zhuǎn)基因株系在高鹽脅迫下通過維持較低的Na+水平和較高的K+水平，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)平衡，增強植株的耐鹽性。

圖10 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根葉片中Na+(A)和K+(B)含量測定Fig.10 Analysis on Na+ (A) and K+ (B) content in transgenic L. japonicus leaves under salt stress

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子最早由Ishiguro等[27]從甘薯中分離得到，隨后不同植物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子相繼被鑒定出來[28-30]。WRKY蛋白都包含1個或者兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，N-端含有1個保守的七肽WRKYGQK，C-端含有1個鋅指結(jié)構(gòu)(Cx4-7Cx22-23HxH/C)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子按照WRKY結(jié)構(gòu)域個數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)類型的不同，可分為3類：第Ⅰ類成員WRKY結(jié)構(gòu)域個數(shù)為2個，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，第Ⅱ、Ⅲ類成員WRKY結(jié)構(gòu)域個數(shù)為1個，第Ⅱ類成員鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，第Ⅲ類成員鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC。根據(jù)親緣關(guān)系及WRKY結(jié)構(gòu)域中個別氨基酸的差異，可將第Ⅱ類WRKY蛋白細分為a、b、c、d、e 5個小類[31]。本研究克隆得到1個鹽誘導(dǎo)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因GmWRKY6(圖1和圖5)，同源蛋白比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)(圖2和圖3)，該基因與野生大豆GsWRKY6相似性最高，親緣關(guān)系最近，因此將其命名為GmWRKY6。GmWRKY6基因位于大豆第15號染色體上，含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2(Cx5Cx23HxH)型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ類b小類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

大量證據(jù)表明，大豆WRKY類轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如GmWRKY21是一個冷脅迫響應(yīng)基因。GmWRKY54可能通過調(diào)控DREB2A和STZ/Zat10抵抗鹽和干旱脅迫。過表達GmWRKY13轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出對鹽和甘露醇脅迫的敏感性增加，對脫落酸的敏感性下降。過表達GmWRKY28提高了擬南芥的耐鹽性，轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率和根長明顯增加[32]。過表達GmWRKY28-like顯著增強了擬南芥的耐鹽性[33]。GmWRKY35基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達，在干旱脅迫下，與對照相比，轉(zhuǎn)基因煙草長勢較好，POD和SOD活性較高，MDA含量和電解質(zhì)滲漏率較低，說明GmWRKY35基因的過表達增強了煙草的抗旱能力[34]。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向苜蓿中導(dǎo)入具有優(yōu)良性狀的目的基因來提升轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性狀，已成為改良農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要途徑。大豆和百脈根的親緣關(guān)系更近，遺傳物質(zhì)更容易交流。因此，采用生物技術(shù)手段，將栽培大豆WRKY類鹽脅迫響應(yīng)基因轉(zhuǎn)入百脈根，利用大豆的優(yōu)良抗逆性狀培育優(yōu)質(zhì)高抗百脈根新品種，增強其在鹽堿地區(qū)的生長能力，對提高百脈根牧草的產(chǎn)量，充分開發(fā)利用鹽堿化土地資源具有重要意義。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法獲得了過表達GmWRKY6基因的轉(zhuǎn)基因百脈根(圖6)。在鹽脅迫下，與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因百脈根長勢較好(圖7)，株高較高，根長較長(圖8)。對相關(guān)生理指標的測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸和葉綠素含量顯著高于對照植株，而丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性顯著低于對照植株(圖9)。脯氨酸含量的大量增加，提高了細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，轉(zhuǎn)基因植株能更好地抵御鹽脅迫造成的損傷。葉綠素的增加有利于維持植株正常的光合作用，使轉(zhuǎn)基因植株保持良好的生長狀態(tài)。丙二醛含量和相對質(zhì)膜透性的降低減輕了轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜的受損程度，使質(zhì)膜維持正常的生理功能。此外，進一步對轉(zhuǎn)基因和對照植株葉片中Na+和K+含量檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在高鹽處理下葉片中Na+含量顯著低于對照植株，但K+含量顯著高于對照植株(圖10)。說明轉(zhuǎn)基因植株在高鹽脅迫下通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)平衡，從而增強百脈根的耐鹽能力。以上結(jié)果說明GmWRKY6的超表達能夠提高百脈根的耐鹽能力。本研究為深入研究GmWRKY6基因的功能和培養(yǎng)百脈根耐鹽新品種奠定了基礎(chǔ)。