閆玲 顧兵， 張麗 馬萍，

1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院（江蘇徐州 221004）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇徐州 221002）

鮑曼不動(dòng)桿菌以其耐藥性廣泛、可以快速獲得抗生素耐藥基因而聞名［1?2］。對(duì)其全基因組分析表明耐藥基因大量表達(dá)［3?5］，由染色體編碼的AmpC酶、頭孢菌素酶等β?內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生使該菌對(duì)很多β?內(nèi)酰胺類藥物存在天然耐藥，但對(duì)頭孢吡肟及碳青霉烯類藥物較穩(wěn)定。然而，由于其生長特性及耐藥特性，隨著時(shí)間推移鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥性逐年上升［6］，嚴(yán)重威脅公共健康，迫切要求臨床實(shí)驗(yàn)室能準(zhǔn)確識(shí)別感染與耐藥趨勢(shì)以提示臨床用藥及實(shí)施感染控制措施。本研究針對(duì)臨床分離的42株CRAB，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該類細(xì)菌可能的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步檢測和分析，為臨床用藥與感染控制的實(shí)施提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集2017年1-4月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院患者臨床送檢標(biāo)本，經(jīng)Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定為至少對(duì)一種碳青霉烯類藥物（亞胺培南）耐藥的42株非重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌，其中30株來源于痰標(biāo)本、5株來源于血液標(biāo)本、6株來源于纖支鏡洗液標(biāo)本、1株來源于腦脊液標(biāo)本。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA?1705、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA?1706購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑與儀器Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀（法國梅里埃公司），ABI2720PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司），DYY?8C型電泳儀（北京六一儀器廠），Bioshine Gelx1850凝膠成像系統(tǒng)（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）。GelRed（美國Biotium公司），dl2000 DNA marker（日本TaKaRa公司），2×Taq PCR MasterMix（北京天根生化科技），亞胺培南粉末、苯酚紅（美國Sigma公司），細(xì)菌蛋白質(zhì)提取液（美國Thermo公司），ZnSO4·7H2O粉末，NaOH粉末，5×TAE（上海捷瑞生物工程），Agarose LE瓊脂糖（美國Promega公司），亞胺培南（IMP）、美羅培南（MEM）藥敏紙片（10 μg）（英國OXIOD公司），哥倫比亞血平板、M?H平板（法國梅里埃公司），胰蛋白胨大豆肉湯（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)采用Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀對(duì)臨床標(biāo)本中分離鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，高級(jí)專家系統(tǒng)對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行核對(duì)修正后給出藥敏結(jié)果（參照CLSI2017版標(biāo)準(zhǔn)判讀）。

1.3.2 Carba NP試驗(yàn)［7］檢測碳青霉烯酶在2 h內(nèi)出現(xiàn)陽性結(jié)果（a管為紅色或桔紅色，b管為黃色）的報(bào)告為產(chǎn)碳青霉烯酶。見圖1。

圖2 mCIM試驗(yàn)Fig.2 mCIM Test

圖1 Carba NP試驗(yàn)Fig.1 Carba NP Test

1.3.3 mCIM［8］檢測碳青霉烯酶刮取1 μL血平板上過夜培養(yǎng)的菌落于胰蛋白胨大豆肉湯（Tryp?tone Soybean Broth，TSB）中，漩渦振搖10～ 15 s；使用無菌鑷子每管加入一張10 μg的美羅培南/亞胺培南紙片，確保整張紙片浸沒在TSB中；在（35±2）℃中培養(yǎng)4 h±15 min；在取出TSB中的美羅培南/亞胺培南紙片前，采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922配制0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?；按CLSI M02文件中常規(guī)紙片擴(kuò)散法的步驟于15 min內(nèi)在M?H平板上涂布上述菌懸液，干燥3～10 min；使用10 μL接種環(huán)取出TSB中的藥敏紙片，在管壁內(nèi)緣擠去多余液體放在涂布有ATCC25922的M?H平板上；在（35±2）℃中培養(yǎng)18～24 h之后，測量抑菌圈直徑大小。抑菌圈直徑為6～15 mm或在16～18 mm內(nèi)有菌落生長，為碳青霉烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19 mm為碳青霉烯酶陰性；見圖2。抑菌圈直徑在16～18 mm，不確定是否存在碳青霉烯酶。

1.3.4 細(xì)菌DNA模板的制備及相關(guān)基因表達(dá)檢測采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。PCR技術(shù)檢測常見碳青霉烯酶基因（blaKPC?2、blaNDM?1、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA?23），外排泵基因（adeB、adeJ）、整合子基因（Int1、Int2），相應(yīng)引物參照文獻(xiàn)由上海生工公司合成，引物序列及退火溫度見表1。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括 DNA模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Kappa檢驗(yàn)比較兩種表型篩選試驗(yàn)與PCR檢測的一致性，Kappa≤0.4說明一致性較差；Kappa≥0.75說明一致性好。

表1 擴(kuò)增基因引物序列、反應(yīng)條件及擴(kuò)增長度Tab.1 Primer sequence，reaction conditions and amplification length of amplified genes

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果42株CRAB中多重耐藥菌株占79.1%，主要表現(xiàn)為對(duì)對(duì)亞胺培南、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟及頭孢曲松耐藥。然而這些多重耐藥的CRAB全部對(duì)替加環(huán)素敏感。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果42株CRAB菌株中36株檢測到碳青霉烯酶基因，blaNDM?1型有14株、blaOXA?23型有33株，其中11株同時(shí)合并兩種基因。

2.3 兩種方法篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的比較以PCR為金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，Carba NP試驗(yàn)篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度為0，特異度為83.3%，Kappa值為0.11。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片時(shí)，其篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度為97.2%，特異度為33.3%，Kappa值為0.88。mCIM試驗(yàn)采用美羅培南紙片時(shí)，其靈敏度為13.8%、特異度為66.6%，Kappa值為0.21。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株與PCR方法一致性好。

2.4 外排泵基因42株CRAB菌株中有39株檢測到外排泵基因（92.8%）。36株經(jīng)PCR檢測碳青霉烯酶基因陽性菌株中檢測到外排泵基因34株（94.4%），6株未檢測到碳青霉烯酶基因菌株中5株檢測到外排泵基因（83.3%），adeJ基因陽性36株，adeB基因陽性35株，多數(shù)菌株兩種外排泵基因同時(shí)存在。

2.5 整合子基因檢測結(jié)果42株CRAB菌株中有25株檢測到Int1基因（59.5%），未檢測到Int2基因。36株P(guān)CR檢測為碳青霉烯酶基因陽性菌株中22株檢測到Int1基因（61.1%），6株未檢測到碳青霉烯酶基因菌株中3株檢測到Int1基因（50%）。CRAB相關(guān)耐藥基因檢測結(jié)果見表2。

3 討論

耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）菌株耐藥機(jī)制有多種：產(chǎn)生碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失或表達(dá)降低、主動(dòng)外排系統(tǒng)過度表達(dá)、青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)改變及整合子機(jī)制等［17］。耐藥機(jī)制中以產(chǎn)碳青霉烯酶為主，主要為A、B和D類碳青霉烯酶，青霉素結(jié)合位點(diǎn)改變少見［18］。A類中blaGES型分布在中東地區(qū)［19］，而blaKPC型罕見［20］；B 類中blaIMP、blaVIM、blaNDM型在鮑曼不動(dòng)桿菌中都有檢出［21-22］；D 類中blaOXA?23、blaOXA?40、blaOXA?51、blaOXA?58、blaOXA?143這 5種亞組是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物獲得性耐藥的首要原因。本試驗(yàn)36株碳青霉烯酶基因陽性菌株中，檢測到blaNDM?1型與blaOXA?23型兩種碳青霉烯酶編碼基因，碳青霉烯酶流行情況同上述研究結(jié)果相同。編碼碳青霉烯酶的基因主要位于可移動(dòng)基因如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，使得耐藥性在鮑曼不動(dòng)桿菌屬間傳播，而且產(chǎn)碳青霉烯酶菌株毒力更強(qiáng)［23］，因此實(shí)驗(yàn)室能夠有效檢測菌株的耐藥機(jī)制對(duì)臨床治療意義重大。

表2 CRAB菌株相關(guān)耐藥基因及碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果Tab.2 Detection of resistance genes and carbapenem phenotype in CRAB strain

為了提高實(shí)驗(yàn)室快速檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的能力，CLSI不斷推出產(chǎn)碳青霉烯酶菌株表型篩選方法，改良Hodge試驗(yàn)被用于體外檢測碳青霉烯酶活性，但難以檢測到產(chǎn)blaNDM型與blaOXA型的菌株，同時(shí)非產(chǎn)酶菌株該試驗(yàn)可能為陽性。Carba NP試驗(yàn)基于pH值與比色法檢測亞胺培南β-內(nèi)酰胺環(huán)是否水解，該試驗(yàn)對(duì)所配試劑的pH值要求嚴(yán)格，且難以檢測到粘液型菌株與產(chǎn)blaOXA?48型菌株。mCIM是采用美羅培南藥敏紙片檢測菌株中是否存在碳青霉烯酶，該方法操作簡便價(jià)格低廉，目前推薦用于產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩選。本試驗(yàn)36株碳青霉烯酶基因陽性菌株中，35株mCIM陽性，Carba NP試驗(yàn)全部陰性。6株未檢測到碳青霉烯酶編碼基因的菌株中，4株mCIM陽性，1株Carba NP陽性。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片時(shí)，與PCR方法的一致性最好（Kappa=0.88）。相比Carba NP，mCIM更適用于產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動(dòng)桿菌的表型篩選。對(duì)于出現(xiàn)表型篩選陽性而基因檢測陰性的菌株是因?yàn)樵囼?yàn)設(shè)計(jì)引物有限未涉及到所有碳青霉烯酶基因，進(jìn)一步說明PCR方法只適用于已知碳青霉烯酶菌株檢測的局限性。

整合子是保守的類似于轉(zhuǎn)座子的DNA元素，具有捕捉與調(diào)動(dòng)基因盒的能力。整合子基因陽性菌株與多藥耐藥顯著相關(guān)［24］，其可作為耐藥基因的載體進(jìn)行耐藥機(jī)制的傳播。Int1是臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中最常檢測到的整合子基因型［25］。本試驗(yàn)42株CRAB菌株中有25株檢測到Int1基因，未檢測到Int2基因，CRAB菌株整合子的攜帶率達(dá)到59.5%，說明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥與 Int1 有關(guān)。blaNDM?1型與blaOXA?23型碳青霉烯酶編碼基因的36株菌中，22株檢測到Int1基因，產(chǎn)酶菌株整合子的攜帶率為61.1%，整合子的存在使獲得性來源的碳青霉烯酶的編碼序列能在不同菌屬間橫向傳播。

耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化（RND）超家族中的Ade?ABC、AdeIJK、AdeFGH與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥相關(guān)。如果編碼這些外排泵蛋白的基因或相關(guān)基因發(fā)生突變可致其高表達(dá)，并且抗菌藥使用的壓力使主動(dòng)外排泵活性增強(qiáng)。研究［26］表明AdeABC外排泵的過度表達(dá)使亞胺培南和美羅培南的MIC值增加了2倍，說明AdeABC外排泵在鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制中起作用，而且與D類碳青霉烯酶作用時(shí)，會(huì)出現(xiàn)協(xié)同耐藥效應(yīng)。FERNANDO［27］研究表明過度表達(dá)的adeB在耐藥中起重要作用。SUGAWARA等［28］研究表明 AdeI?JK表達(dá)的同時(shí)伴有AdeABC的表達(dá)，二者在多重耐藥中具有協(xié)同作用。本試驗(yàn)42株CRAB菌株中有35株檢測到AdeB基因，36株檢測到AdeJ基因，其中32株同時(shí)合并AdeB、AdeJ兩種基因的情況下，伴有blaOXA?23型碳青霉烯酶的存在，提示外排泵基因的過度表達(dá)與碳青霉烯酶協(xié)同作用導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥。

本研究中收集的CRAB菌株全部對(duì)替加環(huán)素敏感，替加環(huán)素作為第一種被FDA批準(zhǔn)上市的甘氨酰四環(huán)素抗菌藥，該藥具有臨床用藥方便、與其他藥物無交叉耐藥且肝腎毒性低等特點(diǎn)［29］。張冀霞等［30］對(duì)11個(gè)城市15家三級(jí)甲等教學(xué)醫(yī)院臨床常見多重耐藥菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明，替加環(huán)素對(duì)臨床常見多重耐藥菌（包括MRSA、VRE、產(chǎn)ESBL及耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌和鮑曼不動(dòng)桿菌）均具有良好的體外抗菌活性。其結(jié)論與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，替加環(huán)素對(duì)CRAB感染治療具有樂觀的前景，但是仍需要做好其藥敏監(jiān)測工作，及時(shí)指導(dǎo)臨床合理用藥。

本研究臨床分離耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，多數(shù)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的同時(shí)伴有外排泵基因、整合子基因的大量表達(dá)。提示臨床醫(yī)生用藥時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵循用藥原則，盡量減少抗生素的選擇性壓力；需要實(shí)驗(yàn)室選擇有效的產(chǎn)碳青酶烯酶表型篩選方法（mCIM）檢測可疑產(chǎn)酶菌株，為CRAB菌株的預(yù)防控制提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。