宋 薇

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

復方紅景天口含片是由紅景天、制何首烏、黃精及甘草4味中藥組成的純中藥復方制劑，具有抗衰老，抗疲勞，改善記憶力，預防和治療老年癡呆的功效。為了更好地控制復方紅景天口含片的質量，本試驗采用薄層色譜(TLC)法對該方中的紅景天、何首烏、黃精藥材進行了定性鑒別；采用高效液相色譜(HPLC)法對紅景天中的紅景天苷及酪醇進行測定，所建立的方法簡便、可靠、重現性好，能保證制劑的質量。

1 材料

1.1儀器Aglient1120型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AE260型萬分之一電子天平(瑞士Mettle公司)；CP225D型十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；R-200型旋轉薄膜蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市予華儀器有限責任公司)；SK3310LHC型超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)。

1.2試藥紅景天苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110818-200401)；酪醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111676-200401)；2，3，5，4′- 四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110844-200606)；復方紅景天口含片(甘肅省醫(yī)學科學院提供，批號：2009091701、2009091702)；所需藥材由蘭州安泰堂中藥飲片有限公司提供，經甘肅省中醫(yī)院何福江實驗員鑒定符合《中國藥典》2010版(一部)，乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1紅景天的鑒別稱取已粉碎過篩的不同批次復方紅景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液旋轉蒸發(fā)儀蒸干，殘渣加5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液備用。分別稱取紅景天苷和酪醇對照品，加入甲醇配制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。稱取缺紅景天的復方紅景天口含片2 g，按口含片供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。稱取紅景天藥材粉末5.0 g，加入100 mL70%乙醇連續(xù)回流提取2小時，過濾，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL，取出5 mL蒸干，50 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取至無色，合并萃取液，蒸干，甲醇溶解，制成供試品溶液。吸取上述溶液分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮(6∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至顯色清晰。結果：供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 紅景天的TLC

2.2何首烏的鑒別稱取已粉碎過篩的不同批次復方紅景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液旋轉蒸發(fā)儀蒸干，殘渣加5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液備用。稱取二苯乙烯苷對照品，加甲醇溶解配制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。稱取缺何首烏的復方紅景天口含片2 g，按口含片供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。稱取0.271 4 g制何首烏標準藥材加95%乙醇50 mL浸泡30分鐘，回流提取2次，1 h/次，合并濾液，濃縮至約3 mL，作為標準藥材對照品溶液。吸取上述溶液分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-水(6∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在 365 nm 熒光下觀察，斑點清晰。結果：供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，見圖2。

3 含量測定

3.1紅景天苷及酪醇含量測定

3.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；預柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm ×12.5 mm)；流動相：乙腈 - 水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

3.1.2 系統(tǒng)適應性試驗 分別精密吸取供試品溶液，陰性樣品溶液，紅景天對照品溶液，酪醇對照品溶液各20 μL，依上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果紅景天苷和酪醇均能得到較好的分離，陰性無干擾，理論塔板數以紅景天苷計N＞3 000，以酪醇計 N＞2 000，見圖 3。

圖3 HPLC色譜圖

3.1.3 溶液的制備

3.1.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取紅景天苷、酪醇和二苯乙烯苷對照品3.21、18.00、1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成濃度分別為 0.321、1.800、0.162 mg/mL的對照品溶液。

3.1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取粉碎過篩的復方紅景天口含片粉末約5 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，合并濾液，減壓濃縮至干，殘渣用甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，作為供試品儲備液，備用。精密量取供試品儲備液10 mL，蒸干，用流動相溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.3.3 陰性樣品溶液的制備 分別精密稱量不含紅景天藥材的復方紅景天口含片陰性樣品各5 g，按“3.1.3.2”項下方法操作制得紅景天陰性樣品溶液。

3.1.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.321 mg/mL的紅景天苷對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于1 mL容量瓶中，流動相定容，分別進樣20 μL，以峰面積為縱坐標，紅景天苷含量(μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=2.84725e-0.007X-0.999435，r=0.999 7。結果表明：紅景天苷在0.642～5.136 μg范圍內呈良好的線性關系。分別精密吸取濃度為1.800 mg/mL的酪醇對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0mL于1 mL容量瓶中，流動相定容，分別進樣20 μL，以峰面積為縱坐標，酪醇含量(μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=1.59549e-0.007X+0.0152195，r=0.999 1。結果表明酪醇在3.600～36.000 μg范圍內呈良好的線性關系。

3.1.5 精密度試驗 取已知濃度的紅景天苷和酪醇對照品溶液，依上述色譜條件各連續(xù)進樣6次，每次20 μL進行測定、計算，得紅景天苷和酪醇濃度的RSD為1.27%和1.08%(n=6)，結果表明儀器精密度較好。

3.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品制得的供試品溶液，精密吸取 20 μL 分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 小時，依“3.1.1”色譜條件進行測定，計算，得紅景天苷和酪醇含量的RSD為2.29%和2.50%。結果表明供試品溶液在24小時內穩(wěn)定性良好。

3.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批號(2009091701)樣品 6份，按“3.1.3.2”項下方法操作制得供試品溶液，分別精密吸取 20 μL，依“3.1.1”色譜條件進樣測定，測得紅景天苷和酪醇平均含量和 RSD值分別為 0.407%、0.0378%和1.74%、1.63%。

3.1.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的復方紅景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入濃度為0.993 mg/mL的紅景天苷對照品溶液及濃度為0.103 mg/mL的酪醇對照品溶液，按“3.1.3.2”項下方法操作制得供試品溶液，依上述色譜條件進樣20 μL測定，計算，得紅景天苷和酪醇的平均加樣回收率和 RSD值分別為 100.29%、99.46%和1.69%、2.25%(n=6)，見表 1。

表1 加樣回收率試驗(n=9)

3.1.9 樣品含量測定 精密稱取粉碎過篩的復方紅景天口含片粉末約5 g，按“3.1.3.2”項下操作制備供試品溶液，依法進樣20 μL測定，計算。2批復方紅景天口含片中，紅景天苷的平均含量和RSD 值分別為 0.399%、0.402%和 2.44%、2.76%；酪醇的平均含量和RSD值分別為0.0375%、0.0372%和 1.54%、1.56%，結果見表 2。

表2 含量測定結果(n=3) %

3.2二苯乙烯苷含量測定

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；預柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm×12.5 mm)；流動相：乙腈 -水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取二苯乙烯苷對照品1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.162 mg/mL的對照品溶液。

3.2.3 供試品溶液的制備 按“3.1.3.2”項下方法制得供試品溶液。

3.2.4 陰性對照品溶液的制備 精密稱取不含制何首烏藥材的復方紅景天口含片樣品約5 g，按“3.2.3”項下方法操作制備何首烏陰性對照品溶液。

3.2.5 系統(tǒng)適應性試驗 分別精密吸取上述3種溶液各 20 μL，依“3.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果表明二苯乙烯苷可以得到較好的分離，陰性無干擾，理論塔板數以二苯乙烯苷計＞3 000。色譜圖見圖4。

圖4 HPLC色譜圖

3.2.6 標準曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.162 mg/mL的二苯乙烯苷對照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μL 于 1 mL 容量瓶中，用流動相定容，分別進樣20 μL測定，以峰面積為縱坐標，二苯乙烯苷的含量(μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=1.280 54e-008X+0.004 483，r=0.999 3。結果表明二苯乙烯苷在0.162～1.944μg范圍內呈良好的線性關系。

3.2.7 精密度試驗 取同一批號供試品溶液，依“3.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，每次20 μL進行測定，計算，測得二苯乙烯苷含量的RSD為0.94%(n=6)，結果表明儀器精密度較好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品溶液于0，2，4，6，8，12，24 小時，分別精密吸取 20 μL，依“3.2.1”項下色譜條件，測得二苯乙烯苷含量的RSD為1.15%。結果表明供試品溶液在24小時內穩(wěn)定性良好。

3.2.9 重復性試驗 精密稱取同一批號(2009091701)樣品6份，按“3.2.3”項下方法操作制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，依“3.2.1”項下色譜條件進樣測定，測得二苯乙烯苷的平均含量為0.051%，RSD 為 2.63%。

3.2.10 加樣回收率 精密稱取已知含量的復方紅景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入濃度為0.571 mg/mL的二苯乙烯苷對照品溶液，按“3.2.3”項下方法操作制備供試品溶液，依“3.2.1”項下色譜條件，進樣20 μL測定，計算。二苯乙烯苷的平均加樣回收率為100.34%，RSD為1.75%(n=9)，結果見表 3。

表3 加樣回收率試驗(n=9)

3.2.11 樣品測定 精密稱取粉碎過篩的復方紅景天口含片粉末5 g，按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液，依“3.2.1”項下色譜條件進行測定，計算，得兩批復方紅景天口含片樣品中二苯乙烯苷的平均含量分別為0.051%、0.052%；RSD分別為2.63%、2.86%，結果見表 4。

表4 含量測定結果(n=6)

4 討論

《中國藥典》2010版(一部)紅景天藥材“鑒別及含量測定”項下僅收載了紅景天苷的TLC及HPLC測定法，而無酪醇的測定，考慮到紅景天苷及其苷元酪醇均為紅景天的重要活性成分［2］，本試驗建立了同時測定復方紅景天口含片中紅景天苷及其苷元酪醇的測定方法，該方法操作簡便、可行，且重現性好，為含紅景天藥材的中藥復方制劑的質量控制標準提供了參考。

本研究曾先后采用乙腈-0.02%磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、乙腈-2%甲醇、乙腈-水等流動相系統(tǒng)，結果發(fā)現乙腈-水(8.5∶91.5)作為流動相分離效果最佳，穩(wěn)定性最好，圖形最佳，故以此作為HPLC法的洗脫系統(tǒng)。