崔晨光

(河北 省行唐縣畜牧工作總站,河北 行唐 050600)

當(dāng)前，隨著人民生活水平的日益提高，對牛奶產(chǎn)品的需求量不斷增加，促進了奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；目焖侔l(fā)展，鮮牛奶及鮮奶制品已成為人們生活必不可少的食品之一。在奶牛養(yǎng)殖過程中，對奶牛疾病的治療離不開抗生素的使用，經(jīng)常被用來治療奶牛的各種感染性疾病,而抗生素在代謝過程中殘留于牛奶當(dāng)中,如果人們飲用含抗生素殘留的牛奶及其制品,也就相當(dāng)于低劑量的吸食抗生素,從而破壞人體內(nèi)的正常機能,也易造成人對抗生素產(chǎn)生耐藥性等問題，不利于人體健康和今后疾病的治療。因此通過加強對牛奶中的抗生素進行檢測，拒收抗生素奶成為當(dāng)前的重中之重。行唐縣作為奶牛養(yǎng)殖大縣，基層奶站在生鮮乳抗生素殘留快速檢測過程中常用的為利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑，該試劑制造商為西班牙ZEU-INMUNOTEC,S.L.。是國內(nèi)乳品企業(yè)推薦基層奶站使用的牛奶廣譜檢測方法，可檢測到β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氯霉素、林可酰胺類等抗生素，其特點是快速，安全和精確，無需樣品前處理，只需一步操作，穩(wěn)定。原理是基于細(xì)菌生長抑制的原理，該試劑盒包括一塊微孔板，每個微孔注有分布了嗜熱芽孢桿菌的瓊脂培養(yǎng)基和 pH 指示劑。當(dāng)在65℃下培養(yǎng)微孔板時，孢子發(fā)育生長，進而降低了培養(yǎng)基的pH 值，在pH 指示劑的作用下，原來的藍(lán)(紫)色將會變?yōu)榫G-黃色。如果牛奶中的抗生素濃度高于的檢測限，微生物的生長和酸的生產(chǎn)將會受到抑制，由于沒有酸生成，瓊脂中的顏色將不會改變?；鶎幽陶驹跈z測過程中，由于各個奶站配備的恒溫培養(yǎng)設(shè)備不同，有時檢測結(jié)果出現(xiàn)有差異，本試驗就是將利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑運用基層配備的具有代表性的三種不同的恒溫培養(yǎng)設(shè)備進行檢測，并讀取結(jié)果，以驗證其在是否存在檢測結(jié)果的誤差，并根據(jù)結(jié)果來總結(jié)經(jīng)驗體會。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

(1)“Eclipse 50 plate”利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑，由上海千慕生物科技有限公司提供。批號：17112102-023；規(guī)格：96次/板；冷藏避光保存(4～12)℃。對于青霉素G檢出限為2～4 ppb。

(2)三元純牛奶250 mL/盒，隨機抽取奶罐純牛奶樣品200 mL

1.2 試驗設(shè)備

K30電熱恒溫孵育器1臺、wp25型電熱恒溫培養(yǎng)箱1臺、DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋一臺、20～200 μL微量移液器一把，槍頭若干。

2 樣品制備

陽性樣品：在三元純牛奶添加濃度為10 ppb的青霉素G抗生素。

陰性樣品：三元純牛奶。

參照樣品：奶罐純牛奶

3 試驗方法

用裁紙刀或剪子沿微孔外側(cè)劃開金屬薄膜。注意不要剪開剩余的微孔板上的金屬薄膜，因為這會使微孔揮發(fā)導(dǎo)致培養(yǎng)基變干。從塑料框上取下已剪開的微孔條。只需簡單地用指尖向上壓微孔條，微孔條即可分離出來。剩余的微孔板需立即放回塑料袋中密封在4～8℃下冷藏儲存。共需取出18個微孔，將要使用的微孔板安放到另一個空的白色塑料架上，分成三組，每組6個微孔，剝開微孔上的膠粘金屬膜，在每個微孔中加入50 μL牛奶樣品，依次為奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品，需做平行試驗，每個樣品加2個孔，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差。每吸取一個奶樣更換一個干凈的吸頭，避免交叉污染。 用膠粘紙小心地密封微孔板(條)，將其垂直放入到已經(jīng)預(yù)熱到65℃的恒溫孵育設(shè)備中。在使用電熱恒溫水浴鍋時，檢測試劑加好樣品后，封口膜將微孔密封，最好裝進自封口塑料袋中封好口，放進水浴鍋中，防止水淹沒試劑，造成無效檢測；必須確保微孔已經(jīng)完全密封。如若在培養(yǎng)過程中有水滴落到微孔中，將會產(chǎn)生錯誤的檢測結(jié)果。培養(yǎng)時間按出廠報告上的時間培養(yǎng)(一般情況為2時45分)，也可按照陰性對照樣品變黃為實驗終止時間，到時間后從微孔側(cè)面觀察結(jié)果。綠-黃色或者黃色表示抗生素不存在(陰性)，藍(lán)-紫色表示抗生素存 在(陽性)，綠-藍(lán)色表示抗生素濃度接近的檢測限。此時建議重做檢測。

3 檢測結(jié)果

3.1 利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑判定檢測結(jié)果對照圖如下

3.2 試驗檢測結(jié)果情況見下圖

由圖中可以看出：

(1)用K30電熱恒溫孵育器對利普斯E50抗生素檢測試劑進行恒溫培養(yǎng)2小時45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為陰性、陰性、陰性、陽性。檢測結(jié)果一目了然，非常容易觀察分辨。

(2)wp25型電熱恒溫培養(yǎng)箱對利普斯E50抗生素檢測試劑進行恒溫培養(yǎng)2小時45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為疑似、疑似、疑似、陽性。陰性樣品退色不是太明顯，檢測結(jié)果不是太容易觀察分辨，如沒有陰性對照，容易誤判為陽性。繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘后，陰性樣品變?yōu)辄S色。

(3)DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋對利普斯E50抗生素檢測試劑進行恒溫培養(yǎng)2小時45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為陰性、陰性、陰性、陽性。檢測結(jié)果一目了然，非常容易觀察分辨。

4 結(jié)論

由試驗結(jié)果可以看出利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對牛奶抗生素進行快速檢測時，不同的恒溫培養(yǎng)設(shè)備之間的檢測結(jié)果是有誤差存在的，K30電熱恒溫孵育器和DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋相對于電熱恒溫培養(yǎng)箱的檢測結(jié)果更加穩(wěn)定。

5 注意事項

(1)由于利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對于抗菌物質(zhì)極其敏感(抗生素，磺胺類藥物以及其它的消毒劑、清洗劑等)，因此應(yīng)在檢測過程中避免與該類物質(zhì)接觸，在開始檢測前應(yīng)徹底清洗雙手，在干凈的臺面進行檢測。否則容易出現(xiàn)假陽性，影響檢測結(jié)果。

(2)利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對牛奶抗生素進行快速檢測時，選用恒溫培養(yǎng)的設(shè)備，溫度必須嚴(yán)格控制在65℃±1℃，超過此溫度條件，檢測結(jié)果會受到影響，嚴(yán)重的就會有假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)。筆者推薦使用干式恒溫孵育器(如：K30電熱恒溫孵育器)，該機器恒溫相對于其他恒溫設(shè)備比較穩(wěn)定，升溫快，溫控較好，不會出現(xiàn)過多的溫度波動。使用電熱恒溫水浴鍋或電熱恒溫培養(yǎng)箱時，在溫度恒定65℃以后，隨時注意觀察溫度，可用溫度計監(jiān)控一下，看溫度偏差是否在±1℃以內(nèi)。應(yīng)注意溫度嚴(yán)格必須控制在65℃±1℃，在使用電熱恒溫水浴鍋過程中，檢測試劑加好樣品后，封口膜將微孔密封，最好裝進自封口塑料袋中封好口，放進水浴鍋中，防止水淹沒試劑，造成無效檢測；電熱恒溫培養(yǎng)箱因為開關(guān)箱門易造成溫度大幅變動，因此可適當(dāng)增加培養(yǎng)時間，不局限于3個小時，同時隨時注意觀察溫度是否正常，可按照陰性樣品變成黃色的時間為終止試驗的時間。

(3)在試驗過程中一定要加陰性和陽性樣品作為對照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。