王昕桐，董宏鑫，劉麗萍

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080）

植物根尖染色體制片技術(shù)，是觀察植物體細(xì)胞染色體最常用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姊妹染色單體變換的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)高等植物是二倍體（diploid），染色體數(shù)目恒定，其根尖細(xì)胞會(huì)進(jìn)行有絲分裂，且每天都有分裂高峰定點(diǎn)時(shí)間段，植物根尖是觀察染色體最常用的材料。在分裂高峰期取樣并固定根尖，經(jīng)過(guò)染色和壓片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到大量處于有絲分裂各時(shí)期的細(xì)胞和染色體[1]。

植物細(xì)胞有絲分裂有明顯的分裂周期，但其長(zhǎng)短不同，通常在十到幾十小時(shí)之間。通過(guò)預(yù)處理可以降低細(xì)胞質(zhì)的粘度，使染色體縮短分散，阻止紡錘體的形成，讓更多的細(xì)胞處于分裂中期。細(xì)胞分裂中期是染色體形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)的最佳時(shí)期，因此預(yù)處理是決定實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵步驟[2]。預(yù)處理可用的試劑有很多，例如秋水仙素、對(duì)二氯苯、8-羥基喹啉等。解離的目的是分解破壞分生細(xì)胞間的果膠質(zhì)，細(xì)胞壁軟化或分解，使細(xì)胞和染色體容易分散；利用壓片技術(shù)將染色體處理在一個(gè)平面，便于形態(tài)、數(shù)量觀察。解離的方法有酸解法和酶解法：酸解法是用鹽酸水解根尖，步驟簡(jiǎn)便容易掌握，廣泛應(yīng)用于染色體計(jì)數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察。根尖分生組織經(jīng)過(guò)酸解法和壓片后，都呈現(xiàn)單細(xì)胞；酶解法常用于染色體顯帶技術(shù)或姊妹染色體交換等研究。本實(shí)驗(yàn)使用的是酸解法制片，效果良好。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本課題采用吊蘭根尖為實(shí)驗(yàn)材料，水培吊蘭根尖具有生長(zhǎng)快、分生區(qū)明顯、取材方便、二倍體植株，染色體數(shù)量適中等特點(diǎn)，是很好的有絲分裂制片實(shí)驗(yàn)材料。吊蘭（Chlorophytum comosum;bracketplant），百合科多年生常綠草本植物。取水培吊蘭1～3毫米具有分生區(qū)的根尖為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)器具和藥品

1.2.1 用具六孔凹面皿，載玻片，蓋玻片，溫度計(jì)，試劑瓶，滴瓶，鑷子，刀片，解剖針，吸水紙。

1.2.2 藥品無(wú)水乙醇，70%乙醇，冰乙酸，鹽酸，8-羥基喹啉，堿性品紅，石碳酸，甲醛，山梨醇，中性樹(shù)膠，二甲苯。

1.2.3 試劑配制卡諾氏固定液配比：無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1；離液配比：無(wú)水乙醇∶38%鹽酸=1∶1。染色液：配方I，石碳酸品紅（Carbol．fuchsin），先配母液 A和 B。母液A：稱(chēng) 3克堿性品紅，溶于100毫升的70%酒精中，此液可長(zhǎng)期保存；母液B：取母液A 10毫升，加入90毫升的5%石碳酸水溶液，2周內(nèi)使用。取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的甲醛。此染色液含有較多的甲醛，在植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中，觀察細(xì)胞核分裂比較適宜。

配方Ⅱ，改良石碳酸品紅：取配方I石碳酸品紅染色液2～10毫升，加入90～98毫升45%的醋酸和1．8克山梨醇（sorbitol）。放置2周后使用染色效果顯著增強(qiáng)，在室溫下不產(chǎn)生沉淀而且比較穩(wěn)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理將水培的吊蘭放在25℃左右的環(huán)境中培養(yǎng)，待根長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，分別于8:00、12:00、16:00三個(gè)時(shí)間段剪下吊蘭根尖，放入0．002mol/L的8-羥基喹啉溶液中，并分組在常溫下分別預(yù)處理 2h、3．5h、5h。

1.3.2 材料固定將前期預(yù)處理的根尖，現(xiàn)用現(xiàn)配卡諾氏固定液，固定材料15～20min后，如果長(zhǎng)期保存可固定24h后轉(zhuǎn)移到70%乙醇中隨時(shí)取用。

1.3.3 解離將固定好的材料水洗2～3次，每次5min。放入現(xiàn)配的解離液（38%濃鹽酸:無(wú)水乙醇=1∶1）解離5min。

1.3.4 染色制片 沖洗解離后的材料用蒸餾水反復(fù)沖洗2～3次后，用鑷子截取5mm根尖放在清潔的載玻片上。將樣本分為兩組并標(biāo)記，一組用改良苯酚品紅染液染色5min，另一組用番紅對(duì)照染液染色10min。分別加少量染色液，直接將染液滴在載玻片解離好的樣品上，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。

1.3.5 鏡檢將玻片標(biāo)本放在干冰或冰箱凍結(jié)，后用雙面刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開(kāi)，滴上中性樹(shù)膠或透明指甲油封片，制成永久制片。利用普通光學(xué)顯微鏡觀察，10×10倍鏡找到目標(biāo)細(xì)胞后，采用10×40倍鏡觀察染色體。找到不同細(xì)胞分裂時(shí)期，數(shù)清染色體個(gè)數(shù)，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采樣時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

表1 不同采樣時(shí)間結(jié)果比較

由表1可知，實(shí)驗(yàn)中因取樣時(shí)間不同，觀察到的結(jié)果差別較大。結(jié)果顯示，對(duì)于吊蘭根尖染色體的制片，應(yīng)盡量選擇在上午7:00～9:00取樣。上午的吊蘭根尖處于分裂高峰期，樣本中處于分裂時(shí)期的細(xì)胞最多，且可以觀察到各個(gè)分裂時(shí)期的染色體形態(tài)，相較于其他時(shí)間段更易于觀察研究。

2.2 不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

8-羥基喹啉預(yù)處理可以使較多的根尖染色體處于分裂中期，此時(shí)的染色體較為短小，均勻分散在細(xì)胞中，易于查清數(shù)目與觀察形態(tài)。實(shí)驗(yàn)選取8:00時(shí)樣本預(yù)處理結(jié)果記錄為表2。

表2 不同預(yù)處理時(shí)間結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)表明，預(yù)處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短：過(guò)短的預(yù)處理時(shí)間會(huì)使染色體形態(tài)較長(zhǎng)，互相交錯(cuò)纏繞，不易查清染色體個(gè)數(shù)；過(guò)長(zhǎng)的預(yù)處理時(shí)間使染色體幾乎全部處于中毒狀態(tài)，染色體聚集計(jì)數(shù)困難也不易觀察到各個(gè)分裂周期的特點(diǎn)與染色體形態(tài)[4]。因此，吊蘭根尖染色體的最佳預(yù)處理時(shí)間應(yīng)以3．5～4h 為宜。

2.3 吊蘭各個(gè)時(shí)期染色體形態(tài)

間期：制片觀察時(shí)，間期細(xì)胞個(gè)數(shù)最多，核膜核仁清晰，有明顯邊緣，此時(shí)觀察不到染色體。前期：細(xì)胞明顯變大，可以看見(jiàn)一些染色體呈較長(zhǎng)螺旋狀的細(xì)絲，通過(guò)螺旋作用染色體漸漸縮短變粗，隨之染色體形態(tài)也就更加清晰，此時(shí)，染色體由兩個(gè)染色單體組成，它們?cè)谥z點(diǎn)處相連接，染色體形成的同時(shí)核膜核仁消失，這標(biāo)志著前期終結(jié)；中期：染色體較粗，形態(tài)數(shù)目最為清晰，觀察效果最好。由于壓片操作，本應(yīng)排列在赤道面上的染色體分散開(kāi)，便于染色體計(jì)數(shù)。這一時(shí)期細(xì)胞中出現(xiàn)紡錘絲，但要仔細(xì)觀察才可看到；后期：排列在赤道板上的每個(gè)染色體，從著絲點(diǎn)處分開(kāi)，數(shù)量加倍，分別移向細(xì)胞兩極。當(dāng)每個(gè)染色體分開(kāi)獨(dú)立時(shí)，每個(gè)染色單體就成為一個(gè)新染色體，即子染色體；末期：兩組子染色體分別到達(dá)兩極后，即末期的開(kāi)始。紡錘體逐漸消失，染色體已經(jīng)分開(kāi)呈濃縮狀態(tài)，兩個(gè)新核逐漸顯現(xiàn)，細(xì)胞拉長(zhǎng)，有縊裂趨勢(shì)。此時(shí)期觀察多個(gè)細(xì)胞會(huì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新核之間會(huì)形成細(xì)胞板。胞質(zhì)分裂：明顯觀察到核仁核膜重新出現(xiàn)，新細(xì)胞壁將要形成，兩個(gè)細(xì)胞即將分隔開(kāi)。

2.4 吊蘭染色體個(gè)數(shù)

鏡檢分裂中期細(xì)胞，可以清晰的觀察到短粗的染色體，共2n=28條。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)吊蘭根尖的制片研究，觀察到了前期、中期、后期、末期理想的染色體制片結(jié)果，確定吊蘭為二倍體草本植物，且染色體數(shù)是2n=28。7:00～9:00時(shí)為吊蘭根尖分生高峰期，此時(shí)通過(guò)3．5～4h的預(yù)處理，酸解法解離，用改良石炭酸品紅滴染5min并進(jìn)行壓片操作后，可以獲得分裂期完整、分裂相清晰的細(xì)胞。

為避免細(xì)胞緊貼在一起，制片過(guò)程中壓片材料要少，材料多會(huì)致使染色體沒(méi)有伸展的余地，不利于計(jì)數(shù)檢測(cè)。溫度明顯影響植物的細(xì)胞周期，在特定的溫度下培養(yǎng)植物根尖，便于掌握其有絲分裂高峰期，得到更多的有絲分裂周期顯著特點(diǎn)的細(xì)胞。解離后用鑷子敲打蓋玻片時(shí)，用力要均勻分布在蓋玻片的每一處，力過(guò)大致使細(xì)胞過(guò)于分散個(gè)別染色體丟失，或蓋玻片滑動(dòng)使細(xì)胞卷曲而被迫放棄分裂相良好的細(xì)胞。