閔 倩，陳雪梅，苗 瀛，吳滌梵，徐 荻

（1.上海薈苒生物科技有限公司，上海，200333；2.上海宇研生物技術(shù)有限公司，上海，200333）

干細(xì)胞可以分泌大量的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）等，這些因子具有對(duì)抗氧化應(yīng)激、修復(fù)創(chuàng)傷、調(diào)節(jié)皮膚色素代謝等作用[1-4]，同時(shí)干細(xì)胞可以通過(guò)旁分泌和細(xì)胞接觸調(diào)節(jié)皮膚真皮干細(xì)胞的分化[5]，因此干細(xì)胞分泌產(chǎn)物具有抗衰老和美容護(hù)膚作用[6]。

機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的主要分泌細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，細(xì)胞因子除了對(duì)自身細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外，還對(duì)鄰近的細(xì)胞以及遠(yuǎn)處的細(xì)胞發(fā)揮旁分泌和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，在促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)方面已有深入研究[7]。人體天然分泌的細(xì)胞因子已發(fā)現(xiàn)的達(dá)上百種，相互協(xié)同發(fā)揮作用，如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（aFGF、bFGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等生長(zhǎng)因子家族成員，可以定向促進(jìn)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞間基質(zhì)的形成，促進(jìn)皮膚損傷組織的修復(fù)[8]。TGF-β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞等組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白、纖粘連蛋白的表達(dá)[9]?；蛑亟M細(xì)胞因子已被作為護(hù)膚添加劑使用，如重組EGF、bFGF等，但淋巴細(xì)胞分泌的天然細(xì)胞因子的皮膚抗衰老作用尚未見報(bào)道。

本研究從新生兒臍帶血提取單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞以及健康產(chǎn)婦羊膜提取擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞這兩種細(xì)胞中分別提取人天然分泌細(xì)胞因子，并對(duì)其中bFGF等細(xì)胞因子含量、促人成纖維細(xì)胞（HFF-1）增殖活性、促膠原蛋白合成能力等方面進(jìn)行了研究和比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

淋巴細(xì)胞分離液（GE Health）；bFGF ELISA檢測(cè)試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；SCF ELISA檢測(cè)試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；人I型膠原ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；APCCD105流式抗體（BD Bioscience）；FITC-CD90流式抗體（BD Bioscience）；FITC-HLA-DR流式抗體（BD Bioscience）；GT-T551培養(yǎng)基（TaKaRa）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；IL-2（上海華新生物高技術(shù)有限公司）；Ⅳ型膠原酶（Sigma）；慶大霉素（浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司）；HFF-1細(xì)胞（中科院上海生命科學(xué)院）；1×PBS溶液（生工，配制滅菌）；通過(guò)安全性質(zhì)檢指標(biāo)的臍帶血和人羊膜（取樣前與胎盤和羊水提供者簽署知情同意書，知情同意書內(nèi)容經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)證）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞制備（1）淋巴細(xì)胞制備：采集健康產(chǎn)婦的新生兒臍帶血，550-600g離心10min分離出上層血漿，56℃滅活后備用。向下層沉淀中加入等體積1×PBS混勻，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心從白膜層分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加1×PBS稀釋，550g離心10min，棄上清。取PBMC細(xì)胞接種到GT-T551無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè)/ml，添加 IL-2（200U/ml）和5%臍帶血漿，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，不同時(shí)間收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，至十八天離心收集培養(yǎng)上清液。

（2）人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制備及鑒定：取健康產(chǎn)婦的胎盤羊膜，無(wú)菌剪剪碎，用0.05%胰酶預(yù)處理。按比例向羊膜沉淀中加入Ⅳ型膠原酶，混勻，置于水浴恒溫振蕩器（37℃，75r/min）2小時(shí)。待羊膜組織溶解95%以上后終止消化，100 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，390g離心10min。取細(xì)胞接種到DMEM/F12完全培養(yǎng)液（含5%FBS慶大霉素50U/ml），調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105/ml，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每隔二到三天進(jìn)行細(xì)胞傳代并收集第十八天的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

隨機(jī)抽取P0-P6代細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，1×106個(gè)細(xì)胞加入20μL抗體，4℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗去多余流式抗體，棄上清，再用300 μL1×PBS溶液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞因子提取將上述兩種培養(yǎng)上清液用1KD超濾膜超濾，去除分子量1000以下的小分子雜質(zhì)，收集截留液待用，標(biāo)記為淋巴細(xì)胞組和間充質(zhì)干細(xì)胞組。

1.2.3 Elisa檢測(cè)用ELISA 試劑盒對(duì)超濾后的上清液中bFGF、TGF-β、IFN-γ、SCF以及人I型膠原蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)，設(shè)置空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔，按試劑盒說(shuō)明書依次進(jìn)行上樣孵育、洗板、二次孵育、洗板、顯色、終止和上機(jī)檢測(cè)操作。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算樣品中bFGF、TGF-β1、IFN-γ、SCF及人I型膠原蛋白含量。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFF-1細(xì)胞（來(lái)源于中科院上海生命科學(xué)院）用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM丙酮酸鈉青鏈霉素混合液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4000個(gè)/200ul，到96孔板，細(xì)胞接種量為4000個(gè)/200ul/孔，將細(xì)胞提取物按照不同濃度（0%，2%，4%，6%，8%，10%）加到各孔中，設(shè)置三復(fù)孔，加培養(yǎng)基后培養(yǎng)箱孵育72h觀測(cè)，加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞于波長(zhǎng)450nm處的吸光度值（OD值），以0%孔為對(duì)照孔，計(jì)算細(xì)胞增殖活性增加百分率。計(jì)算公式：（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD對(duì)照孔）/OD對(duì)照孔

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每種細(xì)胞分別用相同的方法制備三個(gè)批次的提取物，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行隨機(jī)單位組方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用（x ± s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表型

P3代樣品細(xì)胞高表達(dá)CD90，CD105抗體，低表達(dá)HLA-DR抗體，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。（圖1-3）

2.2 細(xì)胞因子含量

淋巴細(xì)胞提取物與間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中bFGF的 含 量 分 別 為（18.00±2.59）pg /mL和（16.48±5.04）pg /mL，無(wú)明顯差異（p=0.68），TGF-β1含 量 分 別 為（19.54±3.33）pg /mL和（10.07±3.63）pg /mL，IFN-γ 含 量 分 別 為（85.43±13.08）pg /mL 和（56.61±7.66）pg /mL，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示淋巴細(xì)胞提取物中TGF-β1與IFN-γ含量均高于干細(xì)胞提取物，二者差異有顯著 性（pTGF-β1=0.029，pIFN-γ=0.034），SCF含量分別為（21.57±7.62）pg /mL和（38.56±6.08）pg /mL，干細(xì)胞提取物中SCF含量顯著高于淋巴細(xì)胞提取物（p=0.043）。（圖4）

2.3 人I型膠原蛋白含量

淋巴細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中人I型膠原蛋白含量分別為（37.80±4.48）pg/mL和（35.93±1.58）pg/mL，兩組膠原蛋白含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.4 HFF-1細(xì)胞形態(tài)觀察

顯微鏡下觀察，未添加細(xì)胞活性提取物的人皮膚成纖維細(xì)胞：細(xì)胞數(shù)量少，縮短，兩頭分叉，排列紊亂，呈衰老狀態(tài)（圖5左）。添加淋巴細(xì)胞提取物和間充值干細(xì)胞提取物培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，排列有序，呈生長(zhǎng)活躍年輕態(tài)（圖5 中、右）。

圖1 空白對(duì)照

圖2. CD90+ /CD105+率84.63%

圖3. HLA-DR-率0.21%

圖4 淋巴細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞提取物細(xì)胞因子含量對(duì)比圖

2.5 促HFF-1 細(xì)胞增殖率

添加細(xì)胞提取物后，HFF-1細(xì)胞增長(zhǎng)率明顯提高，以2%提取物濃度為參照，當(dāng)兩種細(xì)胞提取物濃度從2%增加到4%時(shí)，HFF-1增殖率變化不顯著（P＞0.05）。HFF-1細(xì)胞增殖率從6%開始顯著上升（P ＜0.01）。淋巴細(xì)胞提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞的促進(jìn)作用略高于干細(xì)胞提取物，但兩種細(xì)胞提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

皮膚的老化是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，主要涉及真皮層，如基質(zhì)金屬蛋白酶水平增加導(dǎo)致細(xì)胞間基質(zhì)（ECM）膠原蛋白和彈性纖維降解增加，TGF-1β信號(hào)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致膠原蛋白合成減少等，此外皮下組織血管減少以及結(jié)構(gòu)變化也是皮膚老化的重要因素[10,11]，因此通過(guò)補(bǔ)充細(xì)胞因子激活真皮層細(xì)胞活力在皮膚抗衰老領(lǐng)域有很大的潛力。從多種干細(xì)胞主要是間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物已被證實(shí)具有皮膚抗衰老功效[12,13,14]。

2013年美國(guó)哈佛大學(xué)的Loffredo[15]等科學(xué)家使用老少配的連體共生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將老年小鼠和年輕小鼠的血液進(jìn)行互相交換，四周后老年小鼠肥大的心臟恢復(fù)正常。2015年斯坦福大學(xué)Wyss-Coray[16]教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在老年小鼠和年輕小鼠經(jīng)手術(shù)縫合連體共生一周后兩只小鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生了交換，淋巴細(xì)胞分泌的活性蛋白可以透過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，并改善老年小鼠的學(xué)習(xí)能力和睡眠。由此可見，年輕機(jī)體的淋巴細(xì)胞可以分泌具有抗衰老作用的細(xì)胞活性因子。

本實(shí)驗(yàn)選取新生兒臍帶血和健康產(chǎn)婦羊膜分別提取淋巴細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞并制備細(xì)胞提取物，選擇生長(zhǎng)因子bFGF、SCF、轉(zhuǎn)化因子TGF-β1、淋巴因子IFN-γ為代表性指標(biāo)，測(cè)定細(xì)胞提取物中的細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞提取物含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，干細(xì)胞提取物含有更高水平的SCF，二者含有相似水平的bFGF。

對(duì)體外培養(yǎng)的HFF-1細(xì)胞促增殖以及膠原蛋白合成檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞提取物均具有顯著的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)膠原蛋白合成能力。

圖5 HFF-1未添加活性提取物培養(yǎng)及添加活性提取物培養(yǎng)形態(tài)對(duì)比圖

圖6 淋巴細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞促HFF-1細(xì)胞增殖率對(duì)比圖

bFGF是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)作用；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF具有促進(jìn)各種組織干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化作用；TGF-β1是促進(jìn)皮膚膠原蛋白合成的重要信號(hào)因子；IFN-γ具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤作用，在皮膚病治療領(lǐng)域，除用于抗病毒和細(xì)菌感染等皮膚病外，作為一種強(qiáng)有力的抗纖維化因子也被用于瘢痕疙瘩的治療[17]。因此本研究提示臍帶血來(lái)源的淋巴細(xì)胞與羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞相似，均能分泌豐富的細(xì)胞因子，具有顯著的皮膚抗衰功效，由于其含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，在抑制炎癥、減少瘢痕形成、修復(fù)痘印等方面具有更好的美容應(yīng)用前景。

由于人體細(xì)胞分泌的天然細(xì)胞因子含量甚微，難以定量檢測(cè)，本研究以bFGF、TGF-β1等細(xì)胞因子含量檢測(cè)和體外培養(yǎng) HFF-1細(xì)胞促增殖功能檢測(cè)相結(jié)合，提供了一種細(xì)胞提取物中細(xì)胞因子的活性評(píng)估實(shí)驗(yàn)方法。

天然細(xì)胞分泌的活性蛋白多達(dá)數(shù)百種，這些活性成分構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互協(xié)調(diào)發(fā)揮保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及抵御疾病的作用，雖然目前的研究還不能鑒定所有的細(xì)胞因子作用機(jī)制及其如何綜合發(fā)揮抗衰老效應(yīng)，但是從人體細(xì)胞獲取的天然細(xì)胞因子在抗衰老領(lǐng)域?qū)⒈葐我坏募?xì)胞因子有更重要的應(yīng)用價(jià)值。