沈 馨，馬佳佳，劉文匯，楊少勇，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽(yáng) 441100）

作為柑橘深加工的重要領(lǐng)域，以柑橘為原料進(jìn)行果酒釀制，不僅促進(jìn)了柑橘產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展，而且提高了農(nóng)產(chǎn)品的附加值[1]。雖然柑橘酒富含有機(jī)酸和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，但其存在酸味和苦味偏重的不足[2]，在一定程度上降低了消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的喜好程度，因而積極尋求改善柑橘酒口感的方法是極為必須的。

果酒發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸可平衡酒中的苦澀味，而有機(jī)酸含量過(guò)高亦會(huì)導(dǎo)致果酒口感酸澀[3]。目前研究人員多采用工藝優(yōu)化的方法，通過(guò)添加蔗糖[4]和糯米粉[5]的方式改善柑橘酒的風(fēng)味。通過(guò)將蘋果酸分解為乳酸同時(shí)引起其他有機(jī)酸的變化，在果酒發(fā)酵過(guò)程中添加乳酸菌亦可顯著改善果酒的口感[6]。作為濃香型白酒窖泥中的重要功能菌群，適當(dāng)?shù)娜樗峋a(chǎn)生的乳酸除具有調(diào)和酒味的緩沖功能外，亦可與酒精生成乳酸乙酯，具有提升濃香型白酒品質(zhì)的作用[7]。除此之外，窖泥中的乳酸菌具有較強(qiáng)的酒精耐受性[8]，因而從濃香型白酒窖泥中分離乳酸菌并對(duì)其在柑橘酒中的應(yīng)用潛力進(jìn)行評(píng)價(jià)是較為可行的。

在對(duì)濃香型白酒窖泥中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，將其與酵母菌聯(lián)合發(fā)酵進(jìn)行柑橘酒制備，采用電子舌對(duì)柑橘酒滋味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)的同時(shí)，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)柑橘酒中有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行了解析，通過(guò)本研究的實(shí)施以期為后續(xù)柑橘酒相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘（品種為宮川）、白砂糖：市售；果膠酶（50000U/g）：和氏壁生物技術(shù)有限公司；偏高活性葡萄酒果酒干酵母（其中菌株為釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；牛肉膏、酵母膏、檸檬酸銨、吐溫-80、瓊脂、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、蛋白胨、檸檬酸二銨、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、氯化鈉、酚、異戊醇、氯仿、乙酸鈉、乙醇、乙二胺四乙酸、碳酸鈉和碳酸鈣：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）聚合酶、2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix、10×PCR buffer和T-載體：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物（27F/1495R）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；內(nèi)部液、參比溶液、陰離子溶液和陽(yáng)離子溶液：日本Insent公司；草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；250B數(shù)顯生化培養(yǎng)箱：金壇市榮華儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)FluorChem公司；LC-20ADXR高效液相色譜儀及Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：日本島津公司；SA-402B電子舌（配置CA0、C00、AE1、CT0和AAE測(cè)試傳感器）：日本Insent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)的窖泥車間隨機(jī)選取3個(gè)窖池，編號(hào)分別為A、B和C，從每個(gè)窖池的上層（距地面20 cm）、中層和底層分別挖取100 g左右窖泥，同一窖池的窖泥混合均勻后裝入樣品瓶中，置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌的分離。

1.3.2 窖泥乳酸菌的分離純化及DNA提取

將窖泥樣品10倍梯度稀釋后，取3個(gè)適宜的梯度涂布于含有1%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)2 d，選取菌數(shù)在30～300之間的梯度進(jìn)行菌落形態(tài)記錄。取有透明圈的單菌落劃線，純化3次之后，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。將過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性和革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性的純菌株暫定為疑似乳酸菌[9]。使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法對(duì)菌株基因組DNA進(jìn)行提取[10]，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系：正反向引物各0.5μL，模板0.5μL，dNTP2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，Taq酶0.2μL，超純水18.8μL。其中正反向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為1495R：5'-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3'[11]。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min；4℃保溫[11]。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將擴(kuò)增成功的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定，并將鑒定出的陽(yáng)性克隆子的菌液寄往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)出的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)[12]，以確定其分子學(xué)地位，并使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株乙醇耐受性的測(cè)定

將活化3代的菌株分別接種于乙醇含量分別為0、3%、5%、7%的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃的條件下培養(yǎng)48 h后，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其OD600nm值。

1.3.5 柑橘酒的制作

將成熟的柑橘去皮、分瓣和打漿裝入1 L玻璃瓶中→添加偏重亞硫酸鉀（90 mg/L）→添加100 mg/L果膠酶→用碳酸鈉調(diào)pH值為6.0，用白砂糖調(diào)整糖度為20°Bx→常溫放置12 h→添加200 mg/L干酵母→控溫發(fā)酵（22℃，6 d）→酒渣分離→按照5×106CFU/mL柑橘酒的接種量接種乳酸菌→后發(fā)酵（18℃，20 d）→陳釀→澄清→過(guò)濾→殺菌→裝瓶

1.3.6 柑橘酒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參照郭壯等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。傳感器CAO、AE1、COO、AAE和CTO首先測(cè)得參比溶液電勢(shì)Vr，然后測(cè)得柑橘酒的電勢(shì)Vs，在參比溶液中洗滌后，傳感器COO、AE1和AAE測(cè)得參比溶液電勢(shì)Vr'。Vs-Vr即為酸、苦、澀、咸和鮮味5個(gè)基本味的相對(duì)強(qiáng)度；Vr-Vr'即為柑橘酒后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）的相對(duì)強(qiáng)度。

1.3.7 柑橘酒有機(jī)酸的測(cè)定

將乳酸、草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸和蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品用超純水配制成0.001～3 g/L的梯度，根據(jù)有機(jī)酸濃度和色譜峰峰面積進(jìn)行線性擬合。

樣品處理：取2 mL樣品加200 μL磷酸，流動(dòng)相定容至10 mL，混勻后用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾備用。

色譜條件：流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH2.9），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm[14-15]。

1.3.8 柑橘酒理化指標(biāo)的評(píng)價(jià)

使用Mega7.0 軟件（http：//www.megasoftware.net/）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其他圖均使用Origin 8.6軟件（OriginLab Corp，MA，USA）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA同源性分析

從窖泥樣品中共分離出15株疑似乳酸菌菌株，顯微鏡下觀察均為短桿，所有菌株的菌落均為圓形、顏色為乳白色且邊緣光滑整齊。所有菌株過(guò)氧化氫酶均為陰性，革蘭氏染色均為陽(yáng)性。在提取疑似乳酸菌菌株DNA基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)16S rDNA同源性分析對(duì)15株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行了鑒定，進(jìn)而確定了其分類學(xué)地位，15株菌16S rDNA序列分析結(jié)果如表1所示。

表1 15株菌的16S rDNA序列分析結(jié)果Table 1 16S rDNA sequence analysis of 15 strains

由表1可知，15株疑似乳酸菌均被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），且與L.paracaseiR094 16S rDNA序列同源性均為99%，由此可見(jiàn)，L.paracasei是古襄陽(yáng)窖泥中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

在已知同源性比對(duì)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，本研究進(jìn)一步使用MEGA7.0軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，標(biāo)準(zhǔn)序列中包括作為系統(tǒng)發(fā)育樹外群序列的L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM 1096以及系統(tǒng)發(fā)育樹外群序列的L.zeaeRIA 482和L.rhamnosusNBRC 3425，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 15株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 lactic acid bacteria strains

由圖1可知，15株菌株和2株內(nèi)群菌株形成了第一類群，而外群菌L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM1096分別形成了第二類群和第三類群，且15株菌株的16S rDNA序列同源性均為99%，均鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

2.2 窖泥乳酸菌菌株乙醇耐受性的測(cè)定

在明確各菌株分類學(xué)地位的基礎(chǔ)之上，本研究評(píng)價(jià)了15株乳酸菌的乙醇耐受性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳酸菌菌株酒精耐受試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Alcohol tolerance test results of lactic acid bacteria strains

由圖2可知，15株乳酸菌在含7%乙醇的MRS培養(yǎng)基中仍然可以生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有較好的乙醇耐受性。隨著乙醇含量的升高，乳酸菌的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制（P＜0.05）。

2.3 柑橘酒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步研究添加乳酸菌對(duì)柑橘酒滋味品質(zhì)的影響，本研究采用電子舌技術(shù)對(duì)果酒各滋味指標(biāo)的相對(duì)強(qiáng)度值進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，添加乳酸菌后柑橘酒苦味、咸味、鮮味和豐度（鮮味的回味）相對(duì)強(qiáng)度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，澀味相對(duì)強(qiáng)度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而酸味、后味A（澀味的回味）和后味B（苦味的回味）因使用菌株發(fā)酵特性的不同呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，這說(shuō)明在后發(fā)酵過(guò)程中添加乳酸菌會(huì)顯著影響柑橘酒的滋味品質(zhì)。值得一提的是，酸味是15株乳酸菌發(fā)酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標(biāo)，這可能與乳酸菌菌株產(chǎn)酸和蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力不同有關(guān)。為了進(jìn)一步探討添加乳酸菌對(duì)柑橘酒酸味的影響，采用HPLC技術(shù)對(duì)柑橘酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖3 柑橘酒各滋味指標(biāo)的相對(duì)強(qiáng)度值Fig.3 Relative intensity of each taste index in orange wine

圖4 柑橘酒有機(jī)酸的種類和含量Fig.4 Types and contents of organic acids in orange wine

由圖4可知，柑橘酒中的有機(jī)酸主要是乳酸、檸檬酸和琥珀酸，添加乳酸菌可明顯提升果酒中乳酸的含量，并降低琥珀酸的含量。除此之外，添加乳酸菌的果酒中蘋果酸的含量也較對(duì)照組低，說(shuō)明蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程可以將蘋果酸轉(zhuǎn)為乳酸。L.paracaseiJNC1-1、L.paracaseiJNB2-1、L.paracaseiJNB1-3和L.paracaseiJNB1-2可明顯降低7種有機(jī)酸的總含量，而L.paracaseiJNC2-1、L.paracaseiJNB2-2、L.paracaseiJNA2-3和L.paracaseiJNA2-1可提高果酒中乳酸菌的含量。由此可見(jiàn)，不同乳酸菌菌株的發(fā)酵特性是具有較大差異的。

在解析果酒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度和有機(jī)酸差異的基礎(chǔ)之上，本研究采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）對(duì)果酒滋味品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià)，柑橘酒滋味品質(zhì)的因子載荷圖如圖5所示。

圖5 柑橘酒滋味品質(zhì)的因子載荷圖Fig.5 Factor loading graph of taste quality in orange wine

由圖5可知，第一主成分由咸味和鮮味2個(gè)指標(biāo)組成，其貢獻(xiàn)率為88.95%；第二主成分由豐度（鮮的回味）、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）、苦味和酸味6個(gè)指標(biāo)所組成，其貢獻(xiàn)率為8.50%。柑橘酒滋味品質(zhì)的主成分1與主成分2因子得分圖如圖6所示。

圖6 柑橘酒滋味品質(zhì)的因子得分圖Fig.6 Factor score graph of taste quality in orange wine

由圖6可知，在水平方向上，相對(duì)于對(duì)照組而言，添加乳酸菌的樣品在因子得分圖上的分布整體偏右，結(jié)合因子載荷圖可知，添加乳酸菌發(fā)酵后柑橘酒的鮮味和咸味減弱。L.paracaseiJNB1-3在空間排布上較之其他添加乳酸菌的樣品偏左上，結(jié)合因子載荷圖可知，添加該株菌可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味。由此可見(jiàn)，L.paracaseiJNB1-3在后續(xù)柑橘酒發(fā)酵中可能具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

從濃香型白酒窖泥中共分離出了15株乳酸菌，經(jīng)鑒定均為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），為古襄陽(yáng)酒業(yè)窖泥中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。柑橘酒中的有機(jī)酸主要為乳酸、檸檬酸和琥珀酸，酸味是15株乳酸菌發(fā)酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標(biāo)。在后發(fā)酵過(guò)程中添加乳酸菌會(huì)顯著影響柑橘酒的滋味品質(zhì)，L.paracaseiJNB1-3可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味，在后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)中可能具有一定的應(yīng)用潛力。