楊小麗，尚雪嬌，余海忠，劉文匯，楊少勇，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為我國銷量最大的白酒類型，濃香型白酒是以糧谷為主要原料，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)法發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而成[1]。濃香型白酒的發(fā)酵主要在窖池中完成，窖泥微生物區(qū)系的形成和演變很大程度上決定了產(chǎn)品的質(zhì)量[2]，因而對窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析則顯得尤為重要。目前國內(nèi)學(xué)者常采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段[3-5]和以變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）為代表的指紋圖譜技術(shù)[6-8]揭示窖泥中微生物的多樣性。然而傳統(tǒng)微生物學(xué)手段依賴于純培養(yǎng)技術(shù)，對于多數(shù)營養(yǎng)要求苛刻、嚴(yán)格厭氧的微生物分離較為困難，難以獲取微生物群落更為完整全面的信息[9]。雖然指紋圖譜技術(shù)具有無需培養(yǎng)的技術(shù)優(yōu)勢，但仍存在無法實現(xiàn)樣品間平行分析和圖譜條帶信息量低的缺陷[10]。

以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)具有通量高、準(zhǔn)確率高和試驗周期短的特點，可在分類學(xué)地位“屬”水平上全面客觀地揭示目標(biāo)環(huán)境中微生物群落信息[11]。LIU M等[12]分別采用DGGE和MiSeq技術(shù)對瀘州老窖5年與100年窖泥中的真菌微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGGE僅檢測到了12個菌屬，而Miseq技術(shù)可以檢測到111個菌屬。湖北省是國內(nèi)白酒生產(chǎn)與消費(fèi)的重要省份，2016年白酒產(chǎn)量逾90萬kL，銷售收入近800億元，白酒生產(chǎn)企業(yè)近450家[13]。作為省域副中心城市的襄陽市亦提出了力爭襄陽白酒產(chǎn)業(yè)過百億元，打造鄂酒除稻花香和白云邊之外的湖北白酒“第三極”的行業(yè)發(fā)展目標(biāo)。但是目前關(guān)于襄陽地區(qū)濃香型白酒窖泥微生物多樣性評價的報道尚少。

本研究采用Miseq高通量測序技術(shù)，對4份采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，同時結(jié)合傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對其中蘊(yùn)含的乳酸菌菌株進(jìn)行了分離鑒定，通過本項目的實施以期為華中地區(qū)濃香型白酒窖泥微生物的多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥：采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥車間；E.Z.N.A.RSoil DNA Kit試劑盒：美國OMEGA公司；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液和DNA聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；FastPfuFly脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） 聚合酶、5×Trans StartTMFastPfu Buffer和三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、異戊醇、乙醇、氯仿、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸鈣、三羥甲基氨基甲烷、飽和酚、十二烷基硫酸鈉和醋酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物338F/806R（其中正向引物前端加入7個核苷酸標(biāo)簽）和引物27F/1495R：由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；5810R臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Fluor Chem公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集及DNA提取

從湖北古襄陽酒業(yè)有限公司窖泥車間的4個窖齡為2年的窖池中分上中下3個部位進(jìn)行樣品采集，4個窖池同時建造且深度均為2.2 m，取樣時從每個窖壁的上層（距地面20 cm）、中層（距地面110 cm）和窖底3個位置各取100 g窖泥。將同一窖池來源的窖泥混合均勻后裝入無菌采樣袋中低溫運(yùn)送回實驗室，編號分別為GXY1、GXY2、GXY3和GXY4。采用E.Z.N.A.RSoilDNAKit試劑盒對窖泥中微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA序列V4-V5區(qū)擴(kuò)增及高通量測序

擴(kuò)增體系為：DNA模板10 ng，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix2μL，10×PCR緩沖液4μL，體系用ddH2O補(bǔ)充至20μL。擴(kuò)增條件為：95℃、3 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72、℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃、10 min。PCR產(chǎn)物檢測合格后，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控

將雙端序列進(jìn)行拼接后，根據(jù)核苷酸標(biāo)簽（barcode）信息將拼接好的序列劃分到各樣品，同時去除各條序列中的barcode和引物。在拼接過程中序列需滿足以下條件[14]：

1）重疊區(qū)≥10 bp；

2）最大錯配比率≤0.2；

3）7個barcode堿基不存在錯配；

4）引物堿基錯配數(shù)≤2 bp。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME（v1.7.0）分析平臺[15]按照以下流程進(jìn)行生物信息學(xué)分析：

1）使用PyNAST[16]將序列對齊；

2）采用UCLUST算法[17]，根據(jù)100%和97%的相似性將對齊后的序列進(jìn)行歸并，并建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）；

3）使用ChimeraSlayer軟件[18]進(jìn)行嵌合體檢查，去除含有嵌合體的OTU，同時定義存在所有4個窖泥樣品中的OTU為核心OTU；

4）從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列，使用RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）[19]和Greengenes（Release 13.8）[20]數(shù)據(jù)庫在門、綱、目、科和屬水平明確其分類學(xué)地位，同時計算該OTU在各樣品中的相對含量。若隸屬于某一門、屬或OTU的樣品在所有樣品中的平均相對含量＞1.0%，則將其定義為優(yōu)勢門、屬或優(yōu)勢OTU，若某一OTU在所有樣品中均存在則將其定義為核心OTU。

5）進(jìn)一步從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列，使用FastTree軟件[21]繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）和超1指數(shù)（Chao1 index）等α多樣性指數(shù)進(jìn)行計算。

1.3.5 核酸登錄號

Miseq高通量測序數(shù)據(jù)提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫（http：//metagenomics.anl.gov/），ID號為mgp83537。

1.3.6 乳酸菌的分離鑒定

采用10倍梯度將窖泥樣品倍比稀釋后，分別涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基平板中，于厭氧條件下（85%N2，5%CO2及10%H2）37℃培養(yǎng)48 h后挑取有透明圈的且形態(tài)不同的菌落進(jìn)行分離純化，30%甘油-80℃保藏備用。參照武俊瑞等[22]的方法使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取疑似乳酸菌分離株的基因組DNA并進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增，檢測合格的PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。反饋回的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部相似性比對搜索工具（BLAST）同源性比對分析，繼而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而明確乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

使用Mega5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹；使用在線軟件Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制維恩（Venn）圖；其他圖均使用Origin 8.6軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采集的4個濃香型窖泥樣品共產(chǎn)出140 750條高質(zhì)量16S rDNA序列，平均每個樣品產(chǎn)出35 188條。去除引物和barcode后的序列長度分布圖如圖1所示。

圖1 序列長度分布圖Fig.1 Distribution diagram of sequence length

由圖1可知，去除引物和barcode后，測序序列長度主要集中在440～459 bp，占到序列總數(shù)的84.92%，另有13.98%的序列長度集中在420～439bp。使用PyNAST將序列對齊，共有1466條序列因比對失敗而被剔除，因而共有139284條序列進(jìn)行OTU劃分。4個窖泥樣品16S rDNA V4-V5區(qū)序列測序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

表1 樣品16S rDNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16S rDNA sequencing and number of taxonomical status ofsamples

由表1可知，根據(jù)100%的相似性進(jìn)行UCLUST時共得到了139284條代表性序列，繼而根據(jù)97%相似性劃分得到了4 772個OTU，采用ChimeraSlayer檢測到965個OTU存在嵌合體，去除嵌合體后還剩余3 807個OTU，每個樣品平均1 476個。在OTU劃分的基礎(chǔ)上，本研究將序列鑒定為21個門、59個綱、96個目、199個科和425個屬，其中僅有0.24%和6.14%的序列不能鑒定到門和屬水平。由表1亦可知，在4個窖泥樣品中GXY3的Chao 1指數(shù)最高而GXY1的Shannon指數(shù)最大，由此可見，GXY3窖池中細(xì)菌微生物的豐富度最大而GXY1窖泥細(xì)菌多樣性最高。

2.2 基于各分類學(xué)地位窖泥細(xì)菌相對含量的分析

2.2.1 主要細(xì)菌在門水平上的相對含量分析

古襄陽濃香型白酒窖泥樣品中平均相對含量＞1.0%的細(xì)菌門如圖2所示。

由圖2可知，在門水平上，窖泥中的細(xì)菌類群主要隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其平均相對含量分別為92.02%、2.92%、1.83%和1.28%。

圖2 窖泥中優(yōu)勢細(xì)菌門相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis on the content of the dominant bacteria in pit mud samples in phyla level

2.2.2 主要細(xì)菌在屬水平上的相對含量分析

古襄陽濃香型白酒窖泥樣品中平均相對含量＞1.0%的細(xì)菌屬如圖3所示。

圖3 窖泥中優(yōu)勢細(xì)菌屬相對含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis on the content of the dominant bacteria in pit mud samples in genus level

由圖3可知，窖泥中細(xì)菌主要隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），其平均相對含量分別為77.16%、3.70%、1.64%和1.04%。由此可見，窖泥中細(xì)菌類群主要由隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）的4個屬構(gòu)成，累計相對含量為83.53%。

2.2.3 基于OTU水平的Venn圖分析

本研究進(jìn)一步在OTU水平對窖泥中細(xì)菌菌群的構(gòu)成進(jìn)行了解析，基于OTU水平的Venn圖如圖4所示。

由圖4可知，通過兩步UCLUST劃分，本研究共得到3 807個OTU，雖然核心OTU有241個，僅占OTU總數(shù)的6.33%，但其包含了118 950條序列，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的87.25%。此外，在4個樣品中分別出現(xiàn)3次、2次和1次的OTU分別有420個、532個和2 614個，分別占OTU總數(shù)的11.03%、13.97%和68.66%，其包含的序列數(shù)分別為11839條、2071條和3468條，分別占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的8.68%、1.52%和2.54%。由此可見，雖然有些濃香型窖池較之其他窖池可能含有一些較為獨(dú)特的細(xì)菌種系型，但其平均含量僅為0.001%。

圖4 基于OTU水平的Venn圖Fig.4 Venn diagram based on OTU level

2.2.4 核心OTU相對含量熱圖及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本研究進(jìn)一步繪制了相對含量＞1.0%的核心OTU在各窖泥樣品中相對含量的熱圖，并依據(jù)各OUT的相對含量建立了左側(cè)和上方的聚類樹，結(jié)果如圖5所示。

圖5 相對含量大于1.0%的核心OTU在各窖泥樣品中相對含量的熱圖Fig.5 Heat map of core OTU in pit mud samples with the relative abundance more than 1.0%

由圖5可知，在241個核心OTU中，平均相對含量＞1.0%的OTU有8個，其中7個隸屬于Lactobacillus，1個隸屬于Thermoactinomycetaceae。8個OTU的累計平均相對含量為71.31%，其中均隸屬于Lactobacillus的OTU662和OTU792的平均相對含量為35.01%和16.99%。進(jìn)一步選取上述8個核心OTU中的代表性序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 相對含量大于1.0%OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖6可知，OTU792、OTU662、OTU4536、OTU2192、OTU2891、OTU2828和OTU2357中的代表性序列可以與耐酸乳桿菌（Lactobacillusacetotolerans）形成聚類，而OTU4559雖然可被鑒定到Thermoactinomycetaceae，但無法將其與某一種細(xì)菌形成聚類。

2.3 窖泥中乳酸菌的分離及鑒定

本研究從4個濃香型白酒窖泥樣品中共分離了12株菌株，所有菌株在含有1%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中均可形成透明圈，革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫酶試驗均為陰性，初步鑒定該12株菌為乳酸菌。將12株菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中將序列結(jié)果進(jìn)行了相似性比對，并構(gòu)建了乳酸菌菌株和參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。

圖7 乳酸菌菌株和參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria and reference strains

由圖7可知，12株菌與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）NBRC15889和副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei）JCM8130形成了一個類群，且所有乳酸菌與對應(yīng)的參考菌株同源性均達(dá)到了99%以上。由此可見，本研究分離出的乳酸菌均隸屬于L.paracasei，但僅采用16S rDNA序列同源性比對無法明確其“亞種”分類學(xué)地位。

3 結(jié)論

本研究采用Miseq高通量測序技術(shù)，對4份采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果顯示窖泥中細(xì)菌主要由隸屬于Firmicutes的Lactobacillus、Clostridium、Bacillus和Thermoactinomyces構(gòu)成，經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)其中的乳酸菌均為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。