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腸道病毒71與肺炎支原體二重感染對手足口病患兒免疫功能的影響*

2018-08-08 07:33李文蓮李文菊陳壽珊張翔
關(guān)鍵詞:口病乙組甲組

李文蓮,李文菊,陳壽珊,張翔

(貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 兒童重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563000)

手足口?。╤and foot mouth disedse, HFMD)是由多種腸道病毒引起的兒童傳染性疾病,5歲以下兒童發(fā)病多見。特別是腸道病毒71(entero virus 71,EV71)與肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)二重感染者易發(fā)展為重癥危重型,短時(shí)間內(nèi)迅速進(jìn)展為肺水腫、肺出血以及循環(huán)衰竭等導(dǎo)致死亡或致殘,但二重感染致病情加重機(jī)制不明,本研究旨在從細(xì)胞免疫及體液免疫方面探尋二重感染致病情加重的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月-2017年2月該院PICU收診的120例重癥手足口病患兒為研究對象,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《手足口病診療指南(2010版)》[1]。經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會及患兒家屬同意。

1.2 方法

1.2.1 分組 入院當(dāng)日取咽試紙用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測EV71病毒核酸,被動凝集定量檢測法檢測血肺炎支原體抗體(mycoplasma pneumoniae antibody, MP-IgM),據(jù)EV71和MP是否為陽性或陰性將研究對象分為甲組[EV71(+)、MP-IgM(+)]31例。男性17例,女性14例;平均(3.2±0.5)歲。乙組[EV71(+)、MP-IgM(-)]34例。男16例,女18例;平均(3.1±0.6)歲。丙組 [EV71(-)、MP-IgM(+)]28 例。男性13例,女性15例;平均(3.2±0.8)歲。丁組[EV71(-)、MP-IgM(-)]27例。男性15例,女性12例;平均(3.5±0.4)歲。選取同期健康兒童30例為對照組。各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具可比性。

1.2.2 T淋巴細(xì)胞檢測 入院當(dāng)日抽取靜脈血2 ml,加入EDTA抗凝管,混勻,使血液抗凝,取Tru Count Tube試管,吸取Mutli TEST CD3+/CD4+/CD8+試劑20 μl加入試管。在試管中加入EDTA抗凝全血50 μl,擰上蓋子輕輕顛倒混勻,室溫避光放置15 min,使試劑中的熒光標(biāo)記抗體與各淋巴細(xì)胞亞群的表面抗原特異地結(jié)合。再加入450 μl溶血素溶解紅細(xì)胞,輕輕混勻,避光放置15 min。采用流式細(xì)胞儀(BD流式細(xì)胞儀,美國Becton Dickinson公司)檢測分析。

1.2.3 白細(xì)胞介素6(interleukin6, IL-6)、白細(xì)胞介素10(interleukin6, IL-10)表達(dá)水平檢測 入院當(dāng)日抽取靜脈血3 ml,不抗凝,血塊回縮后3 500 r/min離心15 min,(LD4-2型低溫離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠),留取血清,置入-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用天津原子能公司提供試劑盒由專人?yán)格按照試劑盒操作說明書檢測血清IL-6、IL-10水平。操作流程:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品,輕輕混勻,酶標(biāo)板加蓋,37℃反應(yīng)120 min;棄去液體,甩干;每孔加檢測溶液100 μl,37℃反應(yīng)60 min,洗板5次甩干;依序每孔加底物溶液90 μl,37℃避光顯色30 min;依序每孔加終止溶液終止反應(yīng),用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)血清樣品值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出IL-6、IL-10濃度。

1.2.4 血清IgG、IgA、IgM表達(dá)水平檢測 入院當(dāng)日抽取靜脈血3 ml,不抗凝,血塊回縮后3 500 r/min離心15 min,(LD4-2型低溫離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠),留取血清,置入-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

采用天津原子能公司提供試劑盒由專人嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作檢測血清IgG、IgA、IgM。操作流程:取標(biāo)本血清0.1 ml,加1 ml生理鹽水進(jìn)行稀釋。分別取2個(gè)抗體液1 ml,檢測IgG分別加入10 μl的稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)血清(檢測IgA分別加入40 μl的稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)血清、檢測IgM分別加入80 μl的稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)血清),混勻,37℃下水浴,30 min后用波長340 nm比濁,讀取吸光度,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分別計(jì)算IgG、IgA、IgM濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較做χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平

4組手足口病分別與對照組比較,經(jīng)單因素方差分析,各組間血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD8+差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),采用Dunnett方法進(jìn)行兩兩比較,血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值低于對照組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CD8+高于對照組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4組手足口病兩兩比較,經(jīng)t檢驗(yàn),血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值、丁組至甲組依次降低,CD8+丁組至甲組依次升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 (±s)

表1 4組T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 (±s)

注:1)與甲組比較,P <0.05;2)與乙組比較,P <0.05;3)與丙組比較,P <0.05

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+甲組(n =31) 37.4±3.1 18.2±1.1 23.1±1.3 0.78±0.8乙組(n =34) 40.1±4.81) 20.1±1.01) 21.9±2.21) 0.95±0.71)丙組(n =28) 42.1±3.72) 22.6±0.82) 20.2±0.92) 1.12±0.92)丁組(n =27) 48.2±4.13) 24.8±1.43) 19.5±1.83) 1.27±0.73)對照組(n =30) 56.3±5.2 27.9±2.1 18.1±2.9 1.51±0.7 F值 132.371 43.429 18.078 118.238 P值 0.001 0.002 0.001 0.001

2.2 血清細(xì)胞因子及體液免疫球蛋白比較

4組手足口病分別與對照組比較,經(jīng)單因素方差分析,各組間IL-6、IL-10、IgG、IgM、IgA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);采用Dunnett方法進(jìn)行兩兩比較,IgA、IgG、IgM低于對照組,IL-6、IL-10高于對照組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4組手足口病兩兩比較,采用t檢驗(yàn),IgA、IgG、IgM丁組至甲組依次降低,IL-6、IL-10,丁組至甲組依次升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 2。

表2 4組血清細(xì)胞因子及體液免疫球蛋白比較 (±s)

表2 4組血清細(xì)胞因子及體液免疫球蛋白比較 (±s)

注:1)與甲組比較,P <0.05;2)與乙組比較,P <0.05;3)與丙組比較,P <0.05

組別 IL-6 IL-10 IgG IgM IgA甲組(n =31) 68.2±5.2 38.7±3.2 3.4±0.6 0.44±0.05 0.29±0.08乙組(n =34) 64.3±3.81) 34.2±3.01) 4.0±0.81) 0.66±0.131) 0.39±0.051)丙組(n =28) 60.1±4.72) 24.8±4.92) 4.8±0.92) 0.88±0.22) 0.42±0.12)丁組(n =27) 48.3±2.73) 18.9±3.13) 5.4±0.93) 0.92±0.083) 0.49±0.13)對照組(n =30) 36.8±6.3 14.2±7.2 6.9±1.4 6.9±1.4 0.6±0.11 F值 355.752 235.658 185.529 134.245 126.040

2.3 各組手足口病重癥危重型發(fā)病率比較

4組手足口病重癥危重型發(fā)病率,甲組54.8%(17/31),乙組35.3%(12/34),丙組 33.3%(9/28),丁組7.41%(2/27),經(jīng)χ2檢驗(yàn),比較各組手足口病重癥危重型發(fā)病率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.695,P=0.002);進(jìn)一步χ2檢驗(yàn)的兩兩比較,甲組、乙組、丙組和丁組,重癥危重型發(fā)病率依次降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

手足口病常累及呼吸、循環(huán)及神經(jīng)系統(tǒng),并發(fā)肺水腫、肺出血等嚴(yán)重并發(fā)癥而危急生命。特別是EV71與MP二重感染者更易出現(xiàn)。文獻(xiàn)[2]研究指出,在免疫應(yīng)答過程中,末梢血淋巴細(xì)胞分化發(fā)育成為功能不同的亞群,當(dāng)亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí),導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂,尤其是T淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的數(shù)量和相對比值的變化在免疫系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位。CD3+主要表達(dá)在T細(xì)胞表面,是T細(xì)胞成熟的重要表面標(biāo)志。CD3+T細(xì)胞可分成CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩大類,CD4+T細(xì)胞主要是T輔助細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞主要是細(xì)胞毒T細(xì)胞,活化后能有效清除病毒,是細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要執(zhí)行者,CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞兩者相互誘導(dǎo)、相互制約形成T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和維持免疫自穩(wěn)。當(dāng)T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失衡時(shí),造成抑制性T細(xì)胞(Ts)功能和分化異常造成機(jī)體免疫功能紊亂。研究[3]報(bào)道,重癥手足口病患兒T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的免疫功能降低,不能有效抵御病毒感染,且EV71通過凋亡CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞而抑制細(xì)胞免疫,使 CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值下降,CD8+上升,引起某些特殊細(xì)胞因子如(IL-6,IL-10等)的釋放,造成組織損傷及EV71清除率降低而致疾病加重。本研究中,各手足口病組CD3+、CD4+及CD4+/CD8比值低于對照組,支持重癥手足口病患兒存在細(xì)胞免疫抑制。文獻(xiàn)[4]報(bào)道,在病毒入侵機(jī)體時(shí),首先參與應(yīng)答的是NK細(xì)胞,可直接殺傷受病毒感染的靶細(xì)胞,是機(jī)體防御病毒感染的第一道防線。手足口病患兒T細(xì)胞數(shù)量及功能下調(diào)導(dǎo)致有免疫介導(dǎo)作用的細(xì)胞因子減少,免疫細(xì)胞對EV71病毒的殺傷作用減弱。本研究中手足口病患兒CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值減少,甲組表現(xiàn)更為明顯,說明在手足口病患兒體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失調(diào),免疫抑制,且免疫抑制越重,病情越重。

體液免疫中IgG能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用,中和細(xì)菌毒素和與病毒抗原結(jié)合,使病毒失去感染宿主細(xì)胞的能力而有效地抗感染。IgA有免疫調(diào)理、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能,清除病原體的作用,EV71病毒感染導(dǎo)致手足口病患兒IgA減少,體液免疫功能降低。IgM可結(jié)合補(bǔ)體,是高效能的抗生物抗體。文獻(xiàn)[5]報(bào)道,手足口病患兒Th細(xì)胞免疫抑制能夠?qū)е麦w液免疫功能下降,B細(xì)胞表達(dá)的IgG、IgA及IgM等免疫球蛋白水平下降,引起細(xì)胞免疫及體液免疫降低。對病毒的清除能力下降,導(dǎo)致手足口病患兒病情進(jìn)展,本研究中4組手足口病IgG、IgM、IgA均低于對照組與文獻(xiàn)相符。

IL-6參與免疫和炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化及導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的作用,過量表達(dá)能夠?qū)е陆M織器官炎癥損傷、組織壞死、功能衰竭;IL-10是對T細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用的抑炎因子,能夠反饋性抑制Th2細(xì)胞的表達(dá),調(diào)節(jié)Th細(xì)胞免疫平衡及過度抑制。文獻(xiàn)[6]報(bào)道在手足口病患兒體內(nèi)IL-6及IL-10過度表達(dá),提示患者體內(nèi)存在Th2細(xì)胞的過度表達(dá)、漂移現(xiàn)象及細(xì)胞免疫異常,本研究發(fā)現(xiàn)手足口病IL-6、IL-10升高支持以上觀點(diǎn)。

MP的致病機(jī)制主要有直接侵襲、抗原抗體免疫復(fù)合物反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的組織損傷、MP的細(xì)胞毒素作用、MP代謝產(chǎn)物致病等。MP進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Th1、Th2細(xì)胞,合成分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子,導(dǎo)致保護(hù)性抗炎反應(yīng)。但過度激活和釋放會導(dǎo)致免疫損傷。有研究[7]報(bào)道,MP感染患者CD4+T細(xì)胞減少,CD8+T細(xì)胞升高,CD4+/CD8+比值倒置,病情越重倒置越明顯,病情恢復(fù)越慢;另有文獻(xiàn)[8]報(bào)道,MP感染時(shí)對B細(xì)胞的損害作用較T細(xì)胞大,血清中IgG水平下降更明顯,提示MP感染具有免疫抑制作用。CD8+細(xì)胞大多數(shù)是Ts細(xì)胞,Ts細(xì)胞對非已抗原誘發(fā)的免疫應(yīng)答具有抑制作用,且Ts細(xì)胞功能變化是導(dǎo)致多種免疫異常的重要機(jī)制。本研究中CD3+、CD4+降低,可能是Ts細(xì)胞功能低下,機(jī)體發(fā)生過強(qiáng)的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致免疫損傷,使患者病情加重。文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道,MP可借助特有的黏附結(jié)構(gòu)緊密牢固地吸附于宿主細(xì)胞表面,逃避黏膜纖毛的清除作用及吞噬細(xì)胞的吞噬,且MP與宿主細(xì)胞膜本身有相似的抗原成分,可以逃避宿主免疫監(jiān)視,得以長期存在于宿主體內(nèi)。EV71有一種口袋因子,通常定位在病毒保護(hù)殼口袋內(nèi),存在于EV71表面殼蛋白五聚體周圍的“峽谷”區(qū),比較穩(wěn)定,不易被吞噬細(xì)胞吞噬,當(dāng)EV71與人體細(xì)胞結(jié)合時(shí),這一口袋因子會被擠出口袋,導(dǎo)致病毒顆粒失穩(wěn),隨后分解并將其遺傳物質(zhì)釋放到感染細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制,從而對人體瘋狂進(jìn)攻,最終發(fā)展成肺水腫、肺出血等危及生命。

綜上所述,EV71及MP感染均可致細(xì)胞免疫及體液免疫抑制,且兩者在致病方式、病原體穩(wěn)定性方面均有共同之處,故兩者混合感染則進(jìn)一步加重免疫紊亂,使手足口病患兒病情進(jìn)一步加重發(fā)展為重癥危重型,甚至并發(fā)肺水腫,肺出血等而危及生命。本研究中甲組重癥危重型發(fā)病率高達(dá)54.8%。丁組重癥危重型發(fā)病率僅7.41%,甲組、乙組、丙組與丁組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明EV71與MP二重感染率越高,患兒免疫紊亂越明顯,病情越重,但本研究病例數(shù)少,有待今后進(jìn)一步研究。

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