張一兵，胡繼衛(wèi)，盧鶴翔，董桂蘭

（1.華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 生理教研室，河北 唐山 063210；2.河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺科，河北 唐山 063210；3.華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 形態(tài)實驗室，河北 唐山 063001；4.河北省唐山市人民醫(yī)院 放化科，河北 唐山 063001）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年增加趨勢，預計到2021年，我國乳腺癌患者將達250萬[1]。乳腺癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal receptor 2, HER-2）表達的不同，可分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型（triple negative breast cancer, TNBC）4種不同的分子亞型，每種分子亞型其生物學特征有所不同，因此其預后及治療效果有較大差異[2]。果蠅Zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）是果蠅Zeste基因增強子人類同源物，其高表達可導致細胞失控性增殖，與多個腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。p16是細胞周期負向調(diào)控因子，有抑制細胞增殖作用，其表達降低可導致腫瘤發(fā)生[4]。EZH2和p16異常表達在乳腺癌中的作用多有報道，但有關(guān)其在不同分子分型乳腺癌中的表達少有報道。本研究采用免疫組織化學（簡稱免疫組化）和甲基化PCR分別檢測不同分子亞型乳腺癌中EZH2表達和p16啟動子甲基化狀態(tài)，并分析與臨床病理特征的關(guān)系，探討EZH2與p16啟動子甲基化乳腺癌分子分型及臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取20014年1月-2015年4月唐山人民醫(yī)院乳腺癌手術(shù)標本81例。所有患者為女性，年齡38～81歲，均為首次發(fā)病，無遠處轉(zhuǎn)移癌，術(shù)前沒有接受任何治療，無其他惡性腫瘤病史，患者病理分期、組織學類型判定依據(jù)2004年NCCN指南標準。

1.2 材料和儀器

實驗所需EZH2抗體及免疫組化（SP）試劑（購自北京中杉金橋生物制品有限公司）。石蠟組織DNA提取試劑盒（購自上海生工生物工程公司），DNA甲和DNA甲基化PCR試劑盒（美國Epigentek公司）。PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），ND2000微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo公司），Geldoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司），BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)（日本奧林巴斯）。

1.3 免疫組化檢測乳腺癌組織EZH2蛋白表達

常規(guī)組織病理切片4μm，脫蠟至水，高壓抗原修復，采用免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進行），DAB顯色，蘇木素復染，透明封固。PBS代替一抗設為空白對照。結(jié)果判定：EZH 2的免疫組化結(jié)果主要為細胞核染色，細胞核無染色計1分，染色＜25%計2分，染色在25%～75%計3分，染色≥75%計4分，3～4分為EZH 2高表達，1～2分為EZH 2低表達。

1.4 甲基化PCR檢測乳腺癌組織p16啟動子甲基化狀態(tài)

石蠟組織4 μm厚度連續(xù)切片，取3～5片，根據(jù)試劑盒說明書提取基因組DNA，檢測水平核純度后，亞硫酸氫鈉修飾DNA，若啟動子發(fā)生甲基化，修飾后甲基化胞嘧啶維持不變（Cm），若啟動子未發(fā)生甲基化，DNA修飾后胞嘧啶（C）變?yōu)槟蜞奏ぃ║），修飾后的DNA進行甲基化PCR；p16啟動子甲基化特異性引物：正向5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATC GC-3'， 反 向 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，65℃退火，擴增片段150 bp；p16啟動子非甲基化特異性引物為：正向5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGAT TGT-3'，反向 5'-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3'，60℃退火，擴增片段151 bp。加入反應體系后，95℃預變性5 min，然后95℃延伸30 s，相應退火溫度45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳，gelgreen染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察成像記錄結(jié)果，如出現(xiàn)150 bp產(chǎn)物則為p16基因啟動子發(fā)生了甲基化，如出現(xiàn)151 bp產(chǎn)物，則認為p16基因啟動子未發(fā)生甲基化。

1.5 乳腺癌分子分型

ER、PR和HER-2的診斷主要基于免疫組化檢測。ER 和 PR（-）定義為陰性，ER 和 PR（+）、（++）、（+++）定義為陽性；HER-2免疫組化結(jié)果顯示（-～++）定義為陰性，（+++）定義為陽性。根據(jù)ER、PR和HER-2的實驗結(jié)果，將乳腺癌分為：Luminal A型：ER和（或）PR陽性、HER-2陰性；Luminal B型：ER和（或）PR陽性、HER-2陽性；HER-2過表達型：ER、PR 均陰性，HER-2陽性；三陰型：ER、PR、HER-2均陰性。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用IBM Statistics 22統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分子分型構(gòu)成

81例乳腺癌患者中，22例為Luminal A（27.1%）；25例為Luminal B型（30.8%）；10例為HER-2過表達型（12.3%）；24例為TNBC（29.6%）。

2.2 EZH 2表達與乳腺癌分子分型的關(guān)系

所有乳腺癌患者中，EZH2陽性表達率為49.3%（40/81），Luminal A、Luminal B、HER-2和TNBC 患者，EZH2陽性表達率分別為36.4%（8/22）、36%（9/25）、60%（6/10）和 70.8%（17/24），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 乳腺癌患者不同分子亞型EZH2表達陽性率的比較例（%）

圖1 EZH2在乳腺癌分子亞型的表達 （SP×200）

2.3 p16啟動子甲基化狀態(tài)與乳腺癌分子分型的關(guān)系

所有乳腺癌患者中，p16啟動子甲基化率37%（30/81），Luminal A、Luminal B、HER-2、TNBC 患者中，p16啟動子甲基化率分別為27.2%（6/22）、28%（7/25）、40%（4/10）和54.2%（13/24），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2和圖 2。

表2 乳腺癌患者不同分子亞型p16基因啟動子甲基化的比較 例（%）

圖2 不同分子亞型p16基因甲基化狀態(tài)（MSP）

2.4 EZH2表達和p16啟動子甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

EZH2表達與患者組織分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER受體表達狀況有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、PR和HER-2受體表達無關(guān)（P＞0.05）；p16啟動子甲基化與腫瘤組織分級、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PR、ER和HER-2受體表達無關(guān)（P＞0.05）。見表 3。

表3 EZH2表達和p16啟動子甲基化與乳腺癌臨床特征關(guān)系 例（%）

2.5 EZH2表達和p16啟動子甲基化相關(guān)性

EZH2表達陽性的乳腺癌患者中，p16啟動子甲基化率為52.5%（21/40），EZH2表達陰性患者為21.9%（9/41），相關(guān)分析顯示兩者正相關(guān)（r=0.276）。見表4。

表4 EZH2表達和p16啟動子甲基化狀態(tài)的關(guān)系 例（%）

3 討論

乳腺癌分子分型中以Luminal型最為常見，郝卓芳等[5]報道441例乳腺癌組織中Luminal型（Luminal A+Luminal B）占67.3%A，HER-2過表達型和TNBC型分別占13.8%和19%。本研究也證實乳腺癌患者分子分型中以Luminal型最多，Luminal A、Luminal B、HER-2過表達、TNBC患者所占比例分別為27.1%、30.8%、12.3%和29.6%。不同分子分型的乳腺癌由于基因型的差異而導致乳腺癌組織表型表現(xiàn)不同，同樣的治療方案療效不一，預后也截然不同。鮑萍萍等[6]研究顯示管腔型乳腺癌預后較好，三陰性和HER-2過表達型乳腺癌預后則較差。楊海玉等[7]報道luminal型對內(nèi)分泌治療比較敏感；HER-2過表達型對赫賽汀靶向治療敏感；而三陰型乳腺癌對內(nèi)分泌治療和分子靶向治療都缺乏敏感性。由于TNBC治療選擇少，不能接受針對ER和PR陽性的內(nèi)分泌治療，也不能接受針對HER-2陽性的靶向治療，因此受到研究人員的廣泛重視。

EZH2是一個癌基因，其高表達可促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。文獻報道[8]EZH2高表達的正常乳腺上皮組織癌變的風險增加，其中ER陰性的乳腺上皮組織乳腺癌發(fā)生風險增加4倍。INARI等[9]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移灶中EZH2高表達的乳腺癌患者手術(shù)后容易復發(fā)，預后不良。還有文獻[10]報道接受三苯氧胺內(nèi)分泌治療的乳腺癌患者中，EZH2陽性患者臨床緩解率要低于EZH2陰性者。本實驗顯示在高組織分級、高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性的腫瘤患者中，EZH2呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。不同分子分型的乳腺癌組織中TNBC組陽性表達率最高，有差異，與李杰寶等研究結(jié)果不一致[11]。本研究結(jié)果提示，EZH2表達增加對乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的效果和預后產(chǎn)生不良影響，被認為是判斷乳腺癌預后的重要指標。EZH2高表達可能是TNBC對內(nèi)分泌治療不敏感原因之一，對評估內(nèi)分泌治療療效有一定臨床意義。

p16基因是細胞周期負調(diào)控因子，可抑制CDK4/6蛋白對pRb的磷酸化水平，保持pRb的去磷酸化狀態(tài)以抑制細胞周期調(diào)控因子E2F的活性，阻遏細胞G1/S期轉(zhuǎn)化，抑制細胞增殖[4]。p16基因甲基化導致其活性降低，促進細胞增殖，具有致癌作用。關(guān)于p16基因甲基化在乳腺癌的作用目前還有爭議，AAKARI等[12]認為p16甲基化參與乳腺癌進展，而SHENG等[13]研究顯示p16基因表達異常與乳腺癌的預后沒有關(guān)聯(lián)。本研究顯示高臨床分期、高組織分級的乳腺癌組織中，p16基因甲基化率增高，提示p16甲基化削弱p16抑癌作用，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但不同分子分型的乳腺癌組織中p16甲基化率無差異，一方面可能與筆者納入研究的病例數(shù)少有關(guān)，另一方面可能由于乳腺癌的高異質(zhì)性，不同分子亞型中p16甲基化與其他因子調(diào)控有關(guān)。

本研究中筆者進一步分析EZH2表達與p16甲基化的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)，提示在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中兩者可能存在協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)EZH2的組蛋白甲基化是引起抑癌基因沉默的一種潛在機制。EZH2蛋白具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，催化核小體H3組蛋白第27位賴氨酸（H3K27）發(fā)生三甲基化（H3K27me3），甲基化后的H3K27me3募集PRC2復合物到特定的基因位點，進而沉默靶基因的表達，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。PURKAIT等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因未缺失的腦膠質(zhì)瘤中，EZH2的高表達可導致p16的表達缺失。UEDA等[14]在白血病研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制劑DNze沉默EZH2表達可以導致p16表達上調(diào)，抑制腫瘤干細胞增殖，而敲除p16基因則削弱DNze的治療效果，染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)進一步證實EZH2被募集在p16基因轉(zhuǎn)錄起始點，誘導H3K27三甲基化發(fā)生，進而抑制p16基因表達。為此，筆者推測在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，EZH2可能通過p16甲基化促進腫瘤進展過程。

綜上所述，EZH2表達增加是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，而且多見于惡性程度更高的TNBC患者。p16基因甲基化失活是EZH2作用機制之一。EZH2作為乳腺癌患者內(nèi)分泌治療效果評估和預后反應的一個指標，有潛在的臨床應用價值。但在不同分子分型的乳腺癌組織中，p16基因啟動子甲基化差異不顯著，這可能是由于乳腺癌的異質(zhì)性，不同分子亞型中p16基因甲基化調(diào)控復雜多樣所致。本研究中，筆者只在組織水平檢測EZH2和p16甲基化與乳腺癌分子分型的關(guān)系，詳細的分子機制還有待在細胞分析水平進一步的研究。