周高峰，黃智紅，呂磊，向威，孫瑩，朱金燕，袁敬東，章傳華，吳維

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 1.泌尿外科，2.血液內(nèi)科，湖北 武漢 430022）

膀胱癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度居泌尿系統(tǒng)第2位[1]。研究表明[2-3]，泌尿道持續(xù)感染癥狀與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，炎癥細(xì)胞及其分泌的炎癥因子可使腫瘤微環(huán)境發(fā)生變化，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、移行和分化等生物學(xué)行為。黑色素瘤抗原 A3（melanoma-associated antigen-A3, MAGE-A3）是一種具有顯著組織表達(dá)限制性的腫瘤抗原，文獻(xiàn)報道MAGE-A3與多種腫瘤的大小、臨床分期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等正相關(guān)，提示MAGE-A3通過某種方式參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。核因子kappa B（nuclear factor kappa B,NF-κB）是介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)的中心物質(zhì)。本研究以膀胱癌患者為研究對象，探討MAGE-A3是否通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的炎癥微環(huán)境，進(jìn)而參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，為膀胱癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年6月1日-2016年5月31日在武漢市第一醫(yī)院泌尿外科初次診斷或初次接受治療的膀胱癌患者120例。取術(shù)中切取的膀胱癌組織（膀胱癌組）和正常膀胱組織（遠(yuǎn)離腫瘤邊緣＞3 cm的正常膀胱組織作為對照組）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書。手術(shù)切除的組織立即置于液氮中，并置入-80℃冰箱冷凍保存。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無其他惡性腫瘤病史；②術(shù)前未經(jīng)放化療或其他方式治療；③冷凍切片和病理檢查確診為膀胱癌；④臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心肺功能障礙不宜手術(shù)者；②合并一種或幾種自身免疫性疾?。虎蹏?yán)重肝腎功能障礙或不能控制的高血壓、高血糖；④妊娠。

1.2 主要儀器和試劑

實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）儀（美國Thermo Fisher公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），普通PCR儀（美國Bio-Rad公司），水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（以色列Biological Industries公司），Trizol（美國 Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher公司），熒光定量試劑盒（德國QIAGEN公司），全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），anti-MAGE-A3、anti-p65及 anti-p-p65（美國 Abcam 公司），HRP標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence, ECL）液（美國Thermo Fisher公司），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和白介素1β（interleukin 1β, IL-1β） ELISA試劑盒（美國Abcam公司），所有引物（北京六合華大基因科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測MAGE-A3 mRNA的表達(dá)水平 在Ensemble網(wǎng)站查詢?nèi)薓AGE-A3和管家基因GAPDH的編碼序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，序列如下，MAGE-A3引物：正向5'-GTCGTCGG AAATTGGCAGTAT-3'，反向5'-TGGGGTCCACTTCCA TCAG-3'；GAPDH引物：正向5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3'，反向 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG G-3'。Trizol法提取膀胱癌組織和正常組織的總RNA，采用DNA酶（DNase）處理去除DNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，MAGE-A3和GAPDH特異性引物進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系如下：ddH2O 8.9 μl，正反向引物各0.8 μl，SYBR Green 12.5 μl，cDNA 2 μl， 共 25 μl。 采 用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，57℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH管家基因為內(nèi)參，根據(jù)目的基因的相對表達(dá)量 =2-△△Ct計算結(jié)果。

1.3.2 Western blot檢測MAGE-A3蛋白的表達(dá)水平及p65磷酸化水平 秤取約50 mg組織并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS），使用勻漿器將組織樣品勻漿并加入適量RIPA buffer裂解組織，4℃，12 000 r/min離心取上清即得總蛋白。按體積比總蛋白：5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）loading buffe=4∶1混勻后99℃持續(xù)加熱5 min，置于冰上待樣品冷卻后即可進(jìn)行上樣電泳。電泳結(jié)束后切膠并制備轉(zhuǎn)移“三明治”結(jié)構(gòu)，恒壓30 V濕轉(zhuǎn)過夜。5% BSA室溫封閉1 h，一抗室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液-吐溫（phosphate buffered salinetween, PBST）漂洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育30 min，PBST漂洗3次，每次5 min。ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光采集圖像并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 ELISA檢測膀胱癌組織和正常膀胱組織中TNF-α和IL-1β的含量 取適量膀胱癌組織和正常膀胱組織，加入預(yù)冷的PBS勻漿，4℃，5 000 r/min離心去除上清。加入適量PBS重懸沉淀，冰上超聲裂解細(xì)胞，再次離心后取上清置于冰上備用。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行操作：①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋；②加樣：分別設(shè)置空白孔（空白孔不加任何樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作與待測樣品孔相同）和待測樣品孔；③加酶標(biāo)抗體，37℃溫箱孵育30 min；④配洗滌液，洗滌各反應(yīng)孔5次，每次1 min；⑤加底物，37℃溫箱孵育30 min；⑥洗滌各反應(yīng)孔5次，每次1 min；⑦加試劑顯色；⑧加終止液終止反應(yīng)；⑨測定：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在相應(yīng)波長下測定吸光度（OD值），通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞系T24來源于美國模式培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection, ATCC）細(xì)胞庫，以含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%二氧化碳CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.5 小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）敲減MAGE-A3的表達(dá)水平 購買MAGE-A3 siRNA，采用脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）（以下簡稱LipoTM2000）轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天，將T24細(xì)胞接種于6孔板中，約1×106個/孔，融合度約80%。實驗前溫育適量不含血清的優(yōu)化培養(yǎng)基（以下簡稱Opti-MEM）。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：①稀釋轉(zhuǎn)染試劑LipoTM2000：取適量LipoTM2000和250 μl Opti-MEM混勻，室溫孵育5 min；②稀釋siRNA：取250 μl Opti-MEM和siRNA，混勻；③稀釋后的LipoTM2000與稀釋后的siRNA混合，即①和②混合并混勻，室溫孵育10 min以形成siRNA-LipoTM2000復(fù)合物；④將siRNA-LipoTM2000混合液逐滴滴入培養(yǎng)液中，輕輕搖晃，使之混勻；⑤37℃培養(yǎng)4～6 h后，除去舊培養(yǎng)基，更換新鮮的生長培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中總體MAGE-A3 mRNA和蛋白及炎癥因子的表達(dá)變化

膀胱癌組織與正常膀胱組織中MAGE-A3 mRNA、蛋白及炎癥因子的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（MAGE-A3 mRNA：t=6.664，P=0.000；MAGE-A3蛋白：t=5.877，P=0.000；TNF-α ：t=27.09，P=0.000；IL-1β ：t=37.45，P=0.000），膀胱癌組織中 MAGE-A3 mRNA、蛋白和炎癥因子含量高于正常膀胱組織，見表1和圖1。

2.2 MAGE-A3陽性患者炎癥因子與膀胱癌分期的關(guān)系

120例患者中MAGE陽性56例，陽性率為46.7%。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MAGE-A3陽性率和患者膀胱癌組織中炎癥因子的含量與一般臨床資料無相關(guān)，而與膀胱癌分期正相關(guān)。見表2、3。

2.3 敲減MAGE-A3對NF-κB P65磷酸化及炎癥因子表達(dá)的影響

siRNA敲減MAGE-A3的表達(dá)并驗證（見圖2A），siMAGE-A3組與siCtrl組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（siMAGE-A3 mRNA：t=14.270，P=0.000；p-p65：t=5.817，P=0.000；TNF-α：t=3.252，P=0.017；IL-1β ：t=3.026，P=0.029）siMAGE-A3組NF-κB P65磷酸化水平及TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平均降低，見圖2B、C、D、E。

表1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中炎癥因子的表達(dá)變化（ng/L，±s）

表1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中炎癥因子的表達(dá)變化（ng/L，±s）

組別 TNF-α IL-1β正常膀胱組 89.1±12.6 84.2±15.8膀胱癌組 552.4±186.9 699.5±179.3 t值 27.090 37.450 P值 0.000 0.000

圖1 兩組MAGE-A3 mRNA和蛋白表達(dá)比較

表2 膀胱癌患者不同影響因素的MAGE-A3陽性率的比較

表3 患者腫瘤組織中炎癥因子與臨床病理特征的關(guān)系分析 （ng/L，±s）

表3 患者腫瘤組織中炎癥因子與臨床病理特征的關(guān)系分析 （ng/L，±s）

因素 例數(shù) TNF-α t值 P值 IL-1β t值 P值年齡≥50歲 90 547.9±167.1 0.492 0.624 697.3±177.6 0.228 0.820＜50 歲 30 565.9±192.6 706.1±199.5性別男92 549.2±185.6 0.347 0.729 689.8±201.3 0.992 0.323女28 562.9±173.2 731.4±168.9組織類型透明細(xì)胞癌 90 540.5±197.4686.7±211.5 1.215 0.227其他類型癌 30 588.1±169.3 737.9±159.4 1.183 0.239

續(xù)表3

圖2 MAGE-A3調(diào)控NF-κB P65磷酸化

3 討論

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一[6]，男性發(fā)病率高于女性居第4位，且其世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率有升高趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的存活率與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平最相關(guān)?？ń槊绻嘧⑹悄壳肮J(rèn)的預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的最好策略，其作用機(jī)制是激活膀胱黏膜的非特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)，但嚴(yán)重的副反應(yīng)限制卡介苗的應(yīng)用。因此，尋求一種能夠有效激活機(jī)體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞而無明顯副作用的藥物或靶點成為當(dāng)前亟待解決的問題。

MAGE-A3為MAGE家族成員，除表達(dá)于大部分的黑色素瘤外，還廣泛表達(dá)于其他多種組織類型腫瘤如肺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等，但不表達(dá)于除睪丸和胎盤外的正常組織細(xì)胞[7]，是腫瘤特異性的共同抗原，因而MAGE-A3被認(rèn)為是腫瘤特異性免疫治療的理想免疫原[8]。已有臨床試驗證明將MAGE抗原肽接種至表達(dá)MAGE-A3和HLA-A1分子的黑色素瘤患者體內(nèi)，部分患者腫瘤縮小甚至消失[9]。文獻(xiàn)報道，從人膀胱癌細(xì)胞系SW780中分離出的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞MAGE-A3呈高表達(dá)狀態(tài)[10]；尿道腫瘤組織中MAGE-A3亦呈高表達(dá)狀態(tài)[11]；膀胱移行細(xì)胞癌中MAGE-A3基因有較高表達(dá)，但癌旁組織無表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中MAGE-A3 mRNA、蛋白及炎癥因子的表達(dá)水平高于正常膀胱組織，且與膀胱癌分期正相關(guān)，與文獻(xiàn)報道一致。

慢性炎癥與癌癥的發(fā)生存在密切關(guān)系，炎癥細(xì)胞對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有強(qiáng)大的影響。在腫瘤發(fā)生早期，炎細(xì)胞是其有力的啟動因子，促進(jìn)細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和血管發(fā)生，炎癥細(xì)胞及其產(chǎn)生的趨化因子和細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、移行和分化[13]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌關(guān)聯(lián)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1和VEGF在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的促進(jìn)作用[14]。NF-κB信號通路激活是炎癥誘導(dǎo)的致癌作用的典型代表，文獻(xiàn)報道淋巴毒素β受體激活可促進(jìn)原癌基因Re1A的表達(dá)及NF-κB信號通路炎癥因子TNFα和IL-1β的上調(diào)，進(jìn)而改變腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。由中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR）評估的炎癥水平與尿路上皮腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，低NLR的患者的生存率提高4倍[16]。以上文獻(xiàn)提示，炎癥與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中炎癥因子的表達(dá)水平高于正常膀胱組織，膀胱癌分期呈正相關(guān)性。MAGE-A3是否通過炎癥通路參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，NF-κB p65磷酸化水平及TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平均降低，提示MAGE-A3可能通過炎癥通路參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MAGE-A3可能通過NF-κB信號通路調(diào)控膀胱癌細(xì)胞炎癥狀態(tài)，促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，且與膀胱癌分期密切相關(guān)。