王雪忠張戰(zhàn)泓鄭立敏唐 鑫史曉斌劉 勇*

（1湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長(zhǎng)沙 410125；2湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125；3湖南省蔬菜研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）

番 茄 褪 綠 病 毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），于1998年在美國(guó)佛羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)（Wisler et al.，1998）。截至目前，ToCV已在我國(guó)臺(tái)灣、北京、山東、天津、河北和河南等地發(fā)生流行，對(duì)各地番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；劉永光 等，2014；周濤 等，2014；胡京昂 等，2015；孫國(guó)珍 等，2015）。ToCV侵染的典型癥狀是植株下部葉片先觀察到葉脈間黃化褪綠。發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持綠色外，脈間變黃，葉片變厚；發(fā)病中期，整個(gè)葉片由邊緣向內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)壞死斑；發(fā)病后期，整個(gè)植株死亡，果實(shí)受到嚴(yán)重影響（趙黎明，2015）。早期感染ToCV的番茄產(chǎn)量損失可達(dá)到75%，甚至絕產(chǎn)；中后期感染ToCV仍會(huì)對(duì)番茄造成10%～40%的產(chǎn)量損失（劉永光 等，2014）。該病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夾竹桃科（Apocynaceae）等 6個(gè) 科 植 物（Wintermantel & Wisler，2006；Landeo-Ríos et al.，2015），其中對(duì)番茄造成的產(chǎn)量損失最為顯著。ToCV只能通過(guò)韌皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆蟲(chóng)以半持久的方式傳播，其媒介昆蟲(chóng)包括煙粉虱（Bemisia tabaci）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）、銀葉粉虱（B.argentifolii）和紋翅粉虱（T. abutilonea），其中以煙粉虱的傳播能力最為高效（Wintermantel & Wisler，2006）。目前國(guó)內(nèi)外暫未獲得ToCV的抗性番茄品種（Orfanidou et al.，2016），又因媒介昆蟲(chóng)反復(fù)發(fā)生，雜草清理具有難度，導(dǎo)致ToCV防治存在困難。

2016年7月對(duì)湖南省蔬菜研究所基地進(jìn)行病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯的葉片出現(xiàn)褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色等疑似ToCV感染的癥狀，同時(shí)在病葉上發(fā)現(xiàn)了大量的煙粉虱。故分別采集癥狀明顯的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片樣品，利用ToCV特異性引物進(jìn)行分子鑒定，并檢測(cè)發(fā)病植株上煙粉虱攜帶ToCV的帶毒率以及煙粉虱的生物類型。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染ToCV的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株葉片各20份，以健康番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片作為陰性對(duì)照；以實(shí)驗(yàn)室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片作為陽(yáng)性對(duì)照。采集基地內(nèi)發(fā)病番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株上的煙粉虱，每種植株采集約100頭煙粉虱成蟲(chóng)。將樣品置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)試劑

TRIzol、氯仿、無(wú)水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸內(nèi)切酶（Ase I 酶）、樹(shù)脂溶液（10 mg·mL-1）。

1.3 植物總RNA的提取

樣品總RNA的提取采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取試劑盒，步驟依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 煙粉虱總RNA的提取

煙粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨蟲(chóng)體后加入1 mL TRIzol振蕩15 s，室溫放置4 min；加入200 μL氯仿，漩渦振蕩30 s，室溫放置3 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心 15 min；移取上清液 500 μL 至新的RNase free離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清液，用現(xiàn)配的75%乙醇洗滌沉淀，8 000 r·min-1離心3 min；重復(fù)洗滌1次；棄上清液，8 000 r·min-1離心30 s，小心吸出上清液；室溫晾干3 min，取30 μL RNase-free H2O溶 解， 測(cè) 定OD260/OD280值， 檢測(cè)RNA的含量和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)重復(fù)3次。

1.5 cDNA的合成

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系步驟參照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：在RNase free離心管中分別加入1 μL RNase-free H2O，4 μL Radom hexamers，3 μL 總 RNA；65 ℃加熱 5 min，迅速置于冰上驟冷，并在冰上靜置2 min；向上一步混合液中加入10 μL 2×RT Mix，2 μL HiscriptⅡ Enzyme Mix；混勻后按照25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR和電泳檢測(cè)

ToCV的檢測(cè)采用ToCV特異性引物ToCV-3（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 7 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R 1 μL（10 μmol·L-1），ToCV-3F 1 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板1 μL。PCR程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，產(chǎn)物純化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序分析。

表1 引物信息

1.7 煙粉虱帶毒率的檢測(cè)

從每種植株上采集的煙粉虱中隨機(jī)選取8頭，采用ToCV特異性引物ToCV-3（表1）進(jìn)行ToCV檢測(cè)，每種植株3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)煙粉虱的帶毒率。

煙粉虱帶毒率 = 攜帶ToCV的煙粉虱數(shù)目/ 檢測(cè)煙粉虱數(shù)目×100%

1.8 煙粉虱生物類型的鑒定

煙粉虱總DNA的提?。喝? μL蛋白酶K于封口膜上，將每只煙粉虱置于其中研磨成勻漿后移至PCR管中，加入20 μL 10 mg·mL-1的樹(shù)脂溶液混勻，然后置于37 ℃孵育1 h，96 ℃ 10 min。

PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物 WT（表 1）各 1 μL（10 μmol·L-1），模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

酶切體系：加入Ase I 0.5 μL，3.1×buffer 2 μL，ddH2O 7.5 μL，與10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后置于37 ℃ 3～4 h，酶切后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

從每種植株上采集的煙粉虱中隨機(jī)選取20頭進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄科蔬菜田間感染ToCV的癥狀

與健康植株相比，田間番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯病株的葉片表現(xiàn)出底部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠黃化，葉片變脆且易折。感病嚴(yán)重的植株整株褪綠黃化、果實(shí)不能正常膨大，顏色偏白；葉片脈間褪綠黃化，變厚、變脆且易折（圖 1）。

2.2 茄科蔬菜ToCV的發(fā)生率

對(duì)4種茄科蔬菜上疑似感染ToCV的樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出條帶大小為449 bp的特異性條帶，與目標(biāo)條帶一致（圖2）。對(duì)目標(biāo)條帶純化回收測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示與北京番茄ToCV分離物（KC887999.1）部分序列相似度達(dá)到99.0%，表明所擴(kuò)增到的基因片段屬于ToCV的基因序列，確認(rèn)此次采集的樣品被ToCV感染。檢出率結(jié)果顯示，番茄樣品的ToCV感染率為100%，茄子、辣椒和馬鈴薯樣品的感染率分別為80%、85% 和70%（圖2）。

2.3 煙粉虱體內(nèi)ToCV的帶毒率檢測(cè)

收集病葉上的煙粉虱，并進(jìn)行ToCV的RTPCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到條帶大小為446 bp的特異性條帶，與目標(biāo)片段大小一致（圖3）。從采集的煙粉虱中，每種植株隨機(jī)選取8頭進(jìn)行ToCV帶毒率檢測(cè)（表2），番茄上煙粉虱ToCV的平均感染率最高，為87.5%，其次為茄子和馬鈴薯，辣椒上煙粉虱ToCV的平均感染率最低。

圖1 4種茄科作物感染ToCV的癥狀

圖2 4種茄科蔬菜ToCV PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 煙粉虱生物類型鑒定

圖3 煙粉虱體內(nèi)ToCV PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 4種茄科蔬菜上煙粉虱帶毒率統(tǒng)計(jì)

圖4 煙粉虱生物類型鑒定結(jié)果

對(duì)4種茄科蔬菜上采集的煙粉虱進(jìn)行生物種群鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Ase I消化酶切電泳（圖4），結(jié)果顯示該基地?zé)煼凼鶠镸ED煙粉虱（Q煙粉虱）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采集了湖南省蔬菜研究所基地4種茄科蔬菜植株葉片，利用RT-PCR方法檢測(cè)疑似發(fā)病植株葉片感染ToCV的情況，經(jīng)序列分析比對(duì)，確認(rèn)了ToCV已經(jīng)侵染湖南省的茄科作物，證實(shí)該病毒已經(jīng)在湖南省發(fā)生。近年來(lái)，ToCV對(duì)我國(guó)以番茄為主的蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重大損失，目前針對(duì)ToCV的研究工作主要在其分布、田間診斷和優(yōu)化檢測(cè)技術(shù)、致病機(jī)理、病蟲(chóng)互作等方面展開(kāi)。

2004年Tsai等（2004）在我國(guó)臺(tái)灣首次發(fā)現(xiàn)ToCV，隨后Zhao等（2013）報(bào)道了ToCV在北京的發(fā)生，劉永光等（2014）發(fā)現(xiàn)ToCV在山東暴發(fā)，目前ToCV已在天津（高利利 等，2015）、河北（孫國(guó)珍 等，2015）、河南（胡京昂 等，2015）、山西、陜西、浙江、內(nèi)蒙古（鄭慧新 等，2016）、吉林、遼寧（王翠琳 等，2017）、廣東（湯亞飛 等，2017）、海南（Tang et al.，2017）、云南（劉微 等，2018）等地相繼被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)國(guó)際貿(mào)易的頻繁交流，工廠化苗木調(diào)運(yùn)可能使感染ToCV的植株進(jìn)入我國(guó)，加之煙粉虱在我國(guó)擴(kuò)散流行，這些原因使得ToCV在我國(guó)自沿海向內(nèi)陸迅速蔓延。湖南省周邊省市中目前只有廣東省已經(jīng)報(bào)道了ToCV的發(fā)生，由于湖南省蔬菜種植種類眾多，苗木調(diào)運(yùn)繁雜，這些原因都使得調(diào)查T(mén)oCV病毒最初來(lái)源的工作巨大且復(fù)雜，因此需要進(jìn)一步分離純化和鑒定分離物的病毒株系，對(duì)比確認(rèn)其株系來(lái)源，從而精準(zhǔn)地對(duì)ToCV進(jìn)行防控，同時(shí)應(yīng)通過(guò)加強(qiáng)對(duì)煙粉虱的檢疫檢驗(yàn)，減少人為因素造成煙粉虱的傳播。

在我國(guó)ToCV主要依靠煙粉虱進(jìn)行傳播。2003年首次在云南省一品紅（Euphorbia pulcherrima）上發(fā)現(xiàn)MED煙粉虱以來(lái)（Chu et al.，2006），MED煙粉虱現(xiàn)已遍布全國(guó)。目前的研究顯示，與其他煙粉虱相比，MED煙粉虱具有分布廣泛、擴(kuò)散能力強(qiáng)、繁殖率高、抗藥性強(qiáng)且廣的特點(diǎn)。同時(shí)，在我國(guó)的大多數(shù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，MED煙粉虱已經(jīng)快速取代 MEAM1煙 粉 虱（Chu et al.，2010；Xi，2010；Xin et al.，2016）。已有研究表明，MED煙粉虱比MEAM1煙粉虱傳播ToCV的能力更強(qiáng)（Shi et al.，2017）。因此，應(yīng)正確識(shí)別煙粉虱的生物類型，從而采取正確措施對(duì)煙粉虱進(jìn)行防治，以達(dá)到治蟲(chóng)防病的目的。本試驗(yàn)中煙粉虱ToCV的帶毒率較高，但由于本試驗(yàn)采集的樣本數(shù)量較少，后期應(yīng)擴(kuò)大煙粉虱采集數(shù)量，加強(qiáng)對(duì)煙粉虱攜帶ToCV的監(jiān)測(cè)。

目前ToCV的防治仍以預(yù)防為主，可以通過(guò)選用無(wú)病蟲(chóng)害的幼苗、培育ToCV抗性新品種、田間設(shè)置防蟲(chóng)網(wǎng)、懸掛粘蟲(chóng)板、合理?yè)Q茬，達(dá)到早預(yù)防、早控制的效果。目前ToCV的發(fā)生和流行情況日趨嚴(yán)重，本試驗(yàn)首次報(bào)道ToCV在湖南省的發(fā)生，表明ToCV有從沿海向內(nèi)陸擴(kuò)散的趨勢(shì)，因此必須提高警惕防止ToCV的進(jìn)一步蔓延，同時(shí)要加強(qiáng)對(duì)煙粉虱-ToCV-植物互作的研究，為T(mén)oCV的防治和治理奠定理論基礎(chǔ)。