何宇輝 ，鄧益森 ，彭畔新 ，王愛(ài)軍 ，張曉云 ，李俊杰 ，周曉峰 ，2?

（1.中日友好醫(yī)院 泌尿外科，北京 100029；2.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第十一位，在男性惡性腫瘤中排第七位。其中有將近70%的膀胱癌患者是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[2]。 膀胱癌經(jīng)不同方法治療后，根據(jù)所處的不同風(fēng)險(xiǎn)分組，5年的復(fù)發(fā)率在30%～80%，其中約15%的低級(jí)別腫瘤復(fù)發(fā)為高級(jí)別腫瘤[3]。吸煙和長(zhǎng)期接觸工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品是兩大可能致病因素。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類不同于線性RNA的環(huán)形RNA分子，大多由RNA的3'端和5'端共價(jià)閉合而成環(huán)。環(huán)狀RNA通常不具有ployA尾，對(duì)核酸外切酶不敏感，穩(wěn)定性要強(qiáng)于普通的線性RNA分子，半衰期也要遠(yuǎn)長(zhǎng)于一般的RNA分子[4]，因此環(huán)狀RNA在未來(lái)可以作為一種潛在生物分子標(biāo)記物[5]。研究表明circRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[6]，一些circRNA可通過(guò)序列上存在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)吸附于miRNA，起分子海綿作用，調(diào)控相應(yīng)的靶基因[7]，是目前circRNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。對(duì)于circRNA是如何調(diào)控NMIBC的發(fā)生及發(fā)展，目前還有待進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用Illumina測(cè)序技術(shù)分別對(duì)5例NMIBC患者的癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)的circRNA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后，篩選出差異表達(dá)的circRNA，并運(yùn)用生物信息技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的circRNA集合的來(lái)源基因做注解及基因本體論（GO）分析，根據(jù)差異表達(dá)的circRNA序列對(duì)其可能的靶向miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，為研究NMIBC發(fā)病機(jī)制及尋找潛在的生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集

5例NMIBC患者癌組織及癌旁組織來(lái)自2016年2～6月在中日友好醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的膀胱腫物患者，標(biāo)本從術(shù)中采集并即刻放入非凍型組織RNA保存液（SolarbioR）并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測(cè)。所有患者的腫物組織標(biāo)本術(shù)后病理均證實(shí)為NMIBC。本研究經(jīng)中日友好醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，標(biāo)本的采集均經(jīng)過(guò)家屬授權(quán)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 RNA提取與circRNA芯片檢測(cè)

使用Trizol試劑提取總RNA，1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA樣品是否有降解以及雜質(zhì)，使用凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度。用Ribo-Zero Gold Kits去除樣品中的rRNA，根據(jù)NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，Ispawich，美國(guó)）的操作說(shuō)明進(jìn)行建庫(kù)。構(gòu)建好的文庫(kù)送至博淼生物科技（北京）有限公司進(jìn)行Illumina測(cè)序并質(zhì)控。使用R軟件（版本：v3.1.1）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，按照相對(duì)表達(dá)量比值在1.5倍以上和P＜0.05作為差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 差異circRNA來(lái)源基因功能注解及GO分析

由于目前沒(méi)有對(duì)circRNA進(jìn)行注釋的信息，而對(duì)基因的注釋信息比較完整，因此我們對(duì)circRNA的來(lái)源基因做注釋。通過(guò)統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)circRNA， 并利用 NCBI、Uniprot、GO 和 KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)circRNA的來(lái)源基因進(jìn)行注釋，獲得來(lái)源基因詳細(xì)描述信息。GO是基因功能國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類體系，提供了一套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來(lái)全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)circRNA集合進(jìn)行GO功能顯著性富集分析，來(lái)確定差異表達(dá)circRNA集合行使的主要生物學(xué)功能。

1.4 circRNA與miRNA相關(guān)調(diào)控靶基因預(yù)測(cè)

采用 miRanda（3.3a）軟件[8]的預(yù)測(cè)結(jié)果和靶位點(diǎn)信息。鑒于已知的報(bào)道和序列的可提取性，只選取數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的circRNA進(jìn)行miRNA靶向關(guān)系預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

圖1 差異circRNA聚類圖

2.1 circRNA的差異表達(dá)分析

通過(guò)比較癌組織及癌旁組織circRNA的表達(dá)差異，利用R軟件對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行層次聚類分析，得到差異circRNA聚類圖（圖1）。選取相對(duì)表達(dá)量比值在1.5倍以上和P＜0.05作為差異表達(dá)circRNA，得到上下調(diào)circRNA個(gè)數(shù)。芯片結(jié)果提示，與癌旁正常組織相比，NMIBC患者中表達(dá)量比值在1.5倍以上變化的有315條，其中上調(diào)的有158條，下調(diào)的有157條。篩選差異表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的前10位circRNA并對(duì)circRNA的上游來(lái)源基因做注解（表1）。其中，上調(diào)倍數(shù)最大的circRNA是hsa_circ_0010735，上升表達(dá)倍數(shù)為5.366倍；下調(diào)倍數(shù)最大的circRNA是hsa_circ_0008997，下調(diào)表達(dá)倍數(shù)為4.850倍。

表1 差異表達(dá)的circRNA

圖2 差異circRNA集合的GO統(tǒng)計(jì)柱狀圖

表2 差異表達(dá)circRNA預(yù)測(cè)靶向miRNA及其功能信息

2.2 差異表達(dá)circRNA的功能分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)中總共有3個(gè)部分，分別描述基因的分子功能 （Molecular Function）、細(xì)胞組分（Cellular Component）、 生物過(guò)程 （Biological Process）。對(duì)所篩選得到的已知circRNA進(jìn)行GO分析并根據(jù)功能集合繪制柱狀圖，圖2結(jié)果提示，這些基因主要參與細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控、細(xì)胞器功能、細(xì)胞粘附連接。其中在細(xì)胞組分部分中，下調(diào)的circRNA還可能參與到細(xì)胞膜功能調(diào)節(jié)。

2.3 circRNA與miRNA的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

使用miRanda（3.3a）軟件，對(duì)差異表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的前10位circRNA進(jìn)行逐條預(yù)測(cè)，如表2示，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004045與hsa_miR_7161_3p等4條circRNA分別有1個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。將上述circRNA在circBase、circNet等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢，獲得其功能等信息（如表2）。

3 討論

隨著我國(guó)逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，社會(huì)年齡結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膀胱癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。NMIBC作為膀胱癌最常見(jiàn)的發(fā)病類型，占約70%，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)是治療NMIBC的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，通過(guò)經(jīng)尿道的微創(chuàng)方法并輔以局部卡介苗或化療藥物灌注治療，大部分患者可獲得較好的預(yù)后。膀胱癌中約15%～25%為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，大部分患者需要行根治性膀胱切除術(shù)輔以尿路改道或膀胱替代，創(chuàng)傷大、恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)后相對(duì)較差。研究NMIBC的發(fā)病機(jī)制，尋找NMIBC的標(biāo)志物，以便發(fā)現(xiàn)新的治療方法和及早識(shí)別NMIBC，顯得十分必要。

本研究通過(guò)Illumina測(cè)序技術(shù)篩選了NMIBC患者癌組織及癌旁正常組織中差異表達(dá)的circRNA，通過(guò)NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)circRNA的來(lái)源基因進(jìn)行系統(tǒng)搜索。本研究不僅篩選出多個(gè)已驗(yàn)證的基因，如hsa_circ_0010735、hsa_circ_0007339、hsa_circ_0008275 等[11]，也篩選出hsa_circ_0004045這種未經(jīng)驗(yàn)證的circRNA。對(duì)所篩選得到的已知circRNA集合進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA集合主要參與細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控、細(xì)胞器功能、細(xì)胞粘附連接。在細(xì)胞組分部分中，下調(diào)的cicrRNA還可能參與到細(xì)胞膜功能調(diào)節(jié)。上述研究結(jié)果都為進(jìn)一步的研究提供了方向。

circRNA作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，具有miRNA海綿吸附作用，可通過(guò)影響相應(yīng)miRNA的表達(dá)，進(jìn)而參與靶基因的調(diào)控[12]。目前針對(duì)circRNA海綿吸附作用對(duì)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，已見(jiàn)部分研究報(bào)道。Zhong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA MYLK可通過(guò)海綿吸附作用降低miR-558的活性，通過(guò)調(diào)節(jié)VEGFA/VEGFR2信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，circRNAITCH通過(guò)吸附miR-17/miR-224來(lái)調(diào)節(jié)p21和PTEN表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌進(jìn)展。除了海綿吸附作用，circRNA還可通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，編碼多肽等其他方式發(fā)揮作用[15]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA BCRC4在膀胱癌中起抑制作用，并且至少部分通過(guò)上調(diào)miR-101的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)抗癌功能。但以上均是針對(duì)個(gè)別circRNA的機(jī)制研究，膀胱癌差異表達(dá)的circRNA數(shù)目巨大，鑒于circRNA結(jié)構(gòu)的特殊性，相對(duì)lncRNA而言，目前構(gòu)建合適的circRNA表達(dá)載體仍有一定難度，完整的膀胱癌circRNA發(fā)病機(jī)制研究仍有待各國(guó)科研工作者共同解決。

本研究在NMIBC患者中circRNA差異表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)及預(yù)測(cè)到：hsa_circ_0004045與hsa_miR_7161_3p、hsa_circ_0006328 與hsa_miR_1285_3p、hsa_circ_0000837 與hsa_miR_939_5p、hsa_circ_0002229 與hsa_miR_1183可能存在分子海綿吸附作用，將上述 4個(gè) circRNA在 circBase、circNet等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因信息查詢，發(fā)現(xiàn)上述circRNA分別參與ATP的合成、鈣離子調(diào)控或細(xì)胞膜功能的調(diào)控、BCRA1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和脂質(zhì)代謝等生物過(guò)程。通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)NMIBC的研究報(bào)道，可作為后續(xù)研究的突破點(diǎn)。接下來(lái)可通過(guò)大樣本qPCR驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證各circRNA的表達(dá)情況，并構(gòu)建相應(yīng)circRNA的抑制和過(guò)表達(dá)載體，構(gòu)建體外表達(dá)穩(wěn)定株，尋找在體外細(xì)胞培養(yǎng)下相應(yīng)細(xì)胞表型的變化及其相應(yīng)的信號(hào)通路，使用RT-qPCR、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、免疫印跡技術(shù)等方式進(jìn)一步驗(yàn)證各circRNA與相應(yīng)的miRNA海綿吸附關(guān)系，為探尋潛在的生物標(biāo)志物或分子靶標(biāo)提供新的思路。