劉 蕾 ，馬 亮 ，朱先進 ，唐文雄 ，劉 倩 ，孫麗麗 ，劉尊敬 ?

（1.中日友好醫(yī)院 神經(jīng)科；2.檢驗科；3.放射科，北京 100029）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，Hcy代謝中的酶或輔酶改變會引起Hcy水平異常，亞甲基四氫葉酸還原酶（methleneterahudrofolate reductase，MTHFR）是影響Hcy代謝的一個關鍵酶，MTHFR基因C677T突變可導致血漿Hcy升高。

腦微出血（cerebral microbleed，CMB）是腦小血管病變引起的一種亞臨床腦實質(zhì)損害，以微小出血為主要特征，臨床上無典型癥狀和體征，其影像上的定義為磁敏感加權成像（susceptibility weighted imaging，SWI）或T2梯度回波序列上出現(xiàn)的直徑為2～5 mm的微小的圓形低信號病灶。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HHcy及MTHFR基因多態(tài)性與腦小血管病密切相關，是腦白質(zhì)病變（white matter lesion，WML）的獨立危險因素。 CMB和WML同屬腦小血管病，既往研究表明，CMB與WML嚴重程度密切相關，目前HHcy及MTHFR基因多態(tài)性與CMB的相關性研究較少，結(jié)果尚存在爭論。本研究通過回顧性分析患者MTHFR基因多態(tài)性、HCY水平和影像學資料，探討MTHFR基因多態(tài)性、HCY水平與CMB的相關性及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2014年10月～2015年7月在中日友好醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。納入標準：（1）年齡＞18歲；（2）同意進行MTHFR基因檢測；（3）完成常規(guī)MRI和SWI檢查患者。排除標準：（1）伴有嚴重心、肺功能不全、嚴重肝、腎疾病或惡性腫瘤；（2）合并有其他影響血漿Hcy水平的疾病，如惡性貧血和甲狀腺功能低下；（3）服用影響血漿Hcy水平的藥物，如B族維生素、利尿藥、抗癲癇藥、左旋多巴等；（4）不能完成MRI檢查，如支架或起搏器植入；（5）多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦外傷、腦腫瘤、腦血管畸形等顱內(nèi)病變；阿爾茨海默癡呆、帕金森病等變性??；（6）心房顫動或感染性心內(nèi)膜炎等有心源性栓塞可能患者；（7）腦出血。

收集所有入組患者的基本資料，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病及高脂血癥病史。急性缺血性卒中診斷需符合2010年中國急性缺血性卒中診治指南標準[1]，經(jīng)頭MRI證實。高血壓、糖尿病和高脂血癥的診斷均采用WHO標準。按照是否存在CMB分為CMB組和非CMB組。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿Hcy水平及測定

于入院次日清晨空腹抽取靜脈血2ml，置EDTA抗凝管中，采集后立即充分混勻。采用美國DPC公司IMMUNLITE全自動化學發(fā)光分析儀及配套同型半胱氨酸測定試劑盒（循環(huán)酶法）對Hcy進行檢測（正常值 5～15mmol/L）。

1.2.2 MTHFR基因多態(tài)性測定

患者知情同意后抽取外周靜脈血5ml，具體操作如下：（1）DNA提取：采用QIAGEN提取試劑盒，按照試劑說明書提取DNA，每份樣本提取后均采用Nanodrop1000微量分光光度計測定濃度和純度。（2）引物設計：引物設計參照文獻：MTHFR-F：GAGGCTGACCTGAAGCACTTGA， 標記 Biotin；MTHFR-R：ATGCCTTCACAAAGCGGAAGA； 測序引物：5’-CGTGATGATGAAATCG-3’；由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。（3）PCR擴增：反應體系50μl：上游引物1μl，下游引物1μl，2×master mix25μl，DNA 模 板 2μl， 水 21μl。PCR反應條件為95℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，共 35 個循環(huán)；72℃延伸 10min。 （4）焦磷酸測序：取 25μl PCR 產(chǎn)物，分別加入結(jié)合緩沖液和親和素磁珠，振蕩15min，結(jié)合帶有生物素標記的PCR產(chǎn)物。真空泵吸附結(jié)合液后分別用70%乙醇、變性液和清洗液處理。PCR產(chǎn)物洗脫后加入測序引物。反應液80℃變性2min后上焦磷酸測序儀運行，分析檢測結(jié)果。

1.2.3 其他生化指標測定

于入院后次日清晨空腹抽取靜脈血檢驗血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、血糖（Glu）、尿酸（UA）、肌酐（Cr），采用全自動生化分析儀測定。

1.2.4 MRI

采用GE公司的3.0T磁共振成像系統(tǒng)進行常規(guī) MRI和 SWI檢查。常規(guī) MRI包括 T1、T2、FLAIR以及DWI成像序列。

CMB診斷標準：SWI成像序列上表現(xiàn)為直徑2～5mm的圓形點狀低信號，邊界清楚，周圍無水腫，并排除鈣化、海綿狀血管瘤和橫斷面上大腦各動脈遠端分支的小血管流空影。

所有MRI的判讀由對病史不詳?shù)?名影像科醫(yī)生和2名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生獨立閱片，診斷結(jié)果不一致時，采取多數(shù)人的意見。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學處理應用SPSS 15.0軟件。計量資料組間比較的單因素分析采用獨立樣本的t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。采用Spearman等級相關分析確定血漿Hcy水平和MTHFR基因C677T多態(tài)性與CMB之間的相關性。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本研究納入131例患者，其中男76例，平均年齡 66±10 歲（29～87 歲），急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者79例；CMB組66例，非CMB組65例，CMB組與非CMB組的人口統(tǒng)計學和臨床資料見表1。2組各指標比較，均無顯著性差異（均 P＞0.05），具有可比性。

表1 CMB組與非CMB組的人口統(tǒng)計學和臨床資料比較

表2 2組MTHFR C667T基因型及等位基因分布比較

2.2 血漿Hcy水平與CMB的關系

CMB組平均血漿Hcy水平為14.91±6.68μmol/L，非 CMB組平均血漿 Hcy水平為17.46±13.51μmol/L，組間 Hcy水平無顯著性差異（P=0.383）。Spearman相關分析顯示，血漿Hcy水平與 CMB 無顯著相關性（rs=-0.114，P=0.196）。

2.3 MTHFR基因多態(tài)性與CMB的關系

表2示，2組間不但MTHFR C667T位點CC、CT及TT基因型分布無顯著性差異，C和T等位基因的分布也無顯著性差異。Spearman相關分析顯示，MTHFR C667T 基因型（rs=0.030，P=0.74）及等位基因分布（rs=0.022，P=0.73）與CMB無顯著相關。

3 討論

血漿Hcy受性別、年齡、葉酸水平、生活方式等遺傳多種因素影響，其中MTHFR C667T基因多態(tài)性是最重要的遺傳因素[2]。胞嘧啶堿基（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），該基因編碼的氨基酸由纈氨酸取代丙氨酸，使MRHFR穩(wěn)定性和活性下降，Hcy甲基化為蛋氨酸過程受阻，Hcy蓄積，引起血漿Hcy水平升高。Hcy水平升高已被廣泛證實是心腦血管疾病的獨立危險因素[3]，而且和認知功能下降相關[4]。近年來對卒中亞組分析研究結(jié)果顯示，與大血管性卒中相比，Hcy水平升高與腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)病變等腦小血管病的關系更為密切[5，6]。而MRHFR基因多態(tài)性也被證實和腔隙性腦梗死和WML密切相關，T基因突變可增加WML 的體積[7]。

除了腔隙性腦梗死和WML外，腦小血管病還包括CMB，但是既往Hcy等相關研究較少涉及CMB。CMB反映了小血管的出血傾向，其組織病理基礎為沉積在小血管周圍的含鐵血黃素[8]，多為小動脈玻璃樣變性或者淀粉樣物質(zhì)沉積，導致小血管破裂，紅細胞溶解破壞產(chǎn)生的含鐵血黃素被巨噬細胞吞噬而沉積在血管周圍，常規(guī)MRI技術難以發(fā)現(xiàn)，需要通過SWI或T2梯度回波序列檢測。CMB與腦出血的關系密切，而且是影響腦卒中出血轉(zhuǎn)化、預后及復發(fā)，造成認知功能下降的重要危險因素[9]。目前CMB已明確的危險因素主要有年齡增長、高血壓以及APOE基因多態(tài)性、NOTCH-3基因突變。HCY與CMB的關系尚有爭議，一些研究顯示，急性卒中患者HHcy與CMB無明顯相關[10，11]，也有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中或TIA患者HHcy與CMB顯著相關[11]。我們的研究結(jié)果支持HHcy與CMB無關，并且無論在急性或非急性缺血性卒中人群中，結(jié)論一致。此外，目前尚無MTHFR基因多態(tài)性與CMB關系的研究，我們對此進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與CMB也無關。本研究結(jié)果提示HHcy及MTHFR基因多態(tài)性并非CMB的危險因素。

CMB和WML均屬腦小血管病，兩者密切相關，Yamada等研究[12]發(fā)現(xiàn)CMB的數(shù)目和WML改變程度呈正相關，但是與CMB的小動脈玻璃樣變性或者淀粉樣物質(zhì)沉積導致的出血不同，WML主要和缺血相關，其病理改變?yōu)樯窠?jīng)元脫失、缺血性脫髓鞘和膠質(zhì)細胞增生，主要發(fā)病機制是內(nèi)皮細胞損傷導致小動脈狹窄或閉塞和血腦屏障破壞后炎性細胞因子和膠質(zhì)細胞活化導致炎癥反應[13]；而Hcy水平升高引起的病理改變主要是腦小血管的血管內(nèi)皮細胞損傷或激活炎癥反應，與缺血更為相關[14]。本研究發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與CMB無關，支持兩者在病理和發(fā)病機制中存在的差異。因此，不同的腦小血管病，發(fā)病機制不盡一致，其危險因素也存在差異，臨床進行腦小血管病評價時，應全面評估，方能制定防治方案。

本研究尚存在一些不足，如樣本量偏小，未對血漿Hcy水平及MTHFR基因多態(tài)性與WML的關系，以及在急性缺血性卒中人群中和腔隙性腦梗死亞型的相關性進行分析，今后應進一步擴大樣本量，來探討血漿Hcy水平及MTHFR基因多態(tài)性與WML和不同卒中亞型的相關性。

綜上所述，HHcy和MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦微出血無關。不同類型的腦小血管病的危險因素、病理機制存在差異，對于腦小血管病患者需要全面綜合評估，從而制定防治方案。