鐘志偉 曾慶思 林翰菲 葉永勝 秦積龍宋玉全 向之明 鄧 宇

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是除酒精及其他明確的損肝因素所致， 以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主要特征的一組疾病，病理學(xué)變化為一連續(xù)的病變譜，由非酒精性肝脂肪變性（nonalcoholicfatty liver， NAFL）至非酒精性脂肪 肝 炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH），進(jìn)一步發(fā)展后期甚至可演變?yōu)橹拘愿斡不痆1]。NAFLD目前已成為發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的慢性肝臟疾病，約占10%～ 24%[2]。由于我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活水平的提高，該病的發(fā)生率也逐年提高，且呈低齡化趨勢(shì)，流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，中國(guó)的香港、廣州和上海等發(fā)達(dá)地區(qū)成人本病的患病率約為15%[3]。早期診斷并治療NASH能有效改善肝纖維化，阻止其進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展，故而具有重要的臨床意義[4]。

非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型是探討非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)理、評(píng)價(jià)診斷方法及尋找合理有效治療藥物的重要工具，在非酒精性脂肪肝病的研究中占有舉足輕重的地位。故本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)兔采用高脂高膽固醇飲食，復(fù)制與人類非酒精性脂肪肝病的病理生理學(xué)特點(diǎn)接近，且適合影像學(xué)研究的動(dòng)物模型，并通過 CT灌注掃描（CT perfusion， CTP）結(jié)果與NAFLD病理半定量分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析，探索CTP定量參數(shù)與NAFLD嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。

方 法

1． 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用49只健康的雄性新西蘭大白兔，6～ 8月齡，體重2．2～2．5kg。實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后常規(guī)飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度40%～70%，溫度控制在16°～26°之間，換氣次數(shù)約8～10次/小時(shí)，晝夜明暗交替時(shí)間為12/12。兔均為單籠飼養(yǎng)，自由飲食、攝水。

2． NAFLD模型構(gòu)建

將42只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分配至5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為正常組10只、高脂飲食組4組，每組8只，分別為高脂4周組、高脂8周組 、高脂12周組和高脂16周組。另有補(bǔ)充組7只，高脂飲食組實(shí)驗(yàn)兔死亡時(shí)，隨機(jī)抽取補(bǔ)充。正常組采用標(biāo)準(zhǔn)飲食，各高脂飲食組及補(bǔ)充組采用高脂飲食。高脂飼料為88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇混合制備而成[5-6]。

3． CT灌注成像

先行上腹部CT平掃，確定肝臟和脾臟位置，然后行肝臟CT灌注成像， 對(duì)比劑使用優(yōu)維顯（300 mgI/ml，先靈拜耳，德國(guó)），用量為1．5ml/kg，注射速率1 ml/s， 采用Dynamic 4D動(dòng)態(tài)灌注掃描方案，對(duì)比劑注射后延遲2秒啟動(dòng)掃描。掃描范圍為96mm，自膈頂?shù)狡⑴K。掃描參數(shù)為80 kVp，100 mAs，采集模式為32×1．6 mm，重建層厚/層間距2 mm/0 mm，F(xiàn)OV 150mm，矩陣512×512，球管旋轉(zhuǎn)時(shí)間為0．3秒，采集50個(gè)周期，每個(gè)周期掃描時(shí)間為1．5秒。

4． CT灌注圖像處理及參數(shù)生成

將CT灌注成像數(shù)據(jù)傳輸至三維重建工作站處理SyngoMMWP（VE36A，Siemens，German）， 處理軟件包為VPCT Body。首先進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正，然后計(jì)算生成參數(shù)圖，分別為最大密度投影（maximum intensity projection， MIP），血流量（blood flow，BF），血容量（blood volume， BV），肝動(dòng)脈灌注圖（arterial liver perfusion， ALP），門靜脈灌注圖（portal venous liver perfusion， PVP），肝動(dòng)脈灌注指數(shù)圖（hepatic perfusion index， HPI）。分別在肝右外葉、肝右內(nèi)葉、肝左內(nèi)葉和肝左外葉放置一橢圓形ROI，大小約0．25cm2，盡量與磁共振測(cè)量的位置保持一致，測(cè)量并記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。

5． 病理學(xué)檢查

CT檢查完成后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔。經(jīng)腹腔取肝臟后固定行HE染色，以非酒精性脂肪肝病活動(dòng)評(píng)分（NAFLD activity score，NAS）(0～8分)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔肝臟的脂肪病變進(jìn)行分級(jí)診斷研究，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為中華肝臟病學(xué)會(huì)2010年的修訂版非酒精性脂肪性肝病診療指南[3]，具體見表1。

NAS＜3分 則 可 以 排 除 NASH，NAS＞4分可診斷為NASH，介于兩者之間的為可能NASH（Borderline）。規(guī)定肝脂肪變＞33%但不伴有小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化者為NAFL，肝臟脂肪變性達(dá)不到此程度者為簡(jiǎn)單的肝細(xì)胞脂肪變。

6． 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用IBMSPSS統(tǒng)計(jì)軟件（version 22．0，Chicago， IL， USA）及GraphPad Prism（version 6．01，San Diego， CA， USA）完成。計(jì)量資料均用±s形式表示，對(duì)方差齊的多樣本采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（one-way ANOVA），方差不齊的多樣本采用近似F檢驗(yàn)Welch法。對(duì)多樣本均數(shù)之間的比較，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊使用Duntte’s T3檢驗(yàn)。P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．NAFLD成模情況

圖1 正常實(shí)驗(yàn)兔及NAFLD的肝臟CT平掃。A． 正常實(shí)驗(yàn)兔的肝臟CT；B． 輕度脂肪肝的CT表現(xiàn)；C． 中度脂肪肝的CT表現(xiàn)；D． 重度脂肪肝的CT表現(xiàn)。

本研究高脂飲食組的實(shí)驗(yàn)兔全部發(fā)展為NAFLD，成模率為100%，根據(jù)NAS評(píng)分系統(tǒng)，正常組為9只， NAFL為0只，可疑NASH（Borderline組，NAS為3～4分）13只， NASH組（NAS＞4分）19只 。

2．正常實(shí)驗(yàn)兔及NAFLD肝臟的CT平掃表現(xiàn)

正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔肝臟的CT表現(xiàn)為肝臟密度正常，與豎脊肌密度相當(dāng)（圖1A）；高脂飲食組輕度脂肪肝者表現(xiàn)為肝密度略減低，密度低于豎脊肌，肝臟體積略增大（圖1B）；中度脂肪肝者表現(xiàn)為肝密度進(jìn)一步降低，肝臟體積進(jìn)一步增大（圖1C）；重度脂肪肝者表現(xiàn)為肝密度顯著降低，明顯低于豎脊肌，肝臟體積明顯增大 (圖1D)。

不同組間（正常對(duì)照組與Borderline組、NASH組）肝臟CT值、肝臟/豎脊肌CT比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值及Welch值分別為34．289和55．411，P值均為0．000），經(jīng)用LSD或Duntte’s T3方法進(jìn)行多重比較，各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NASH組＜Borderline組＜正常對(duì)照組（P均＜0．05）（表2）。

3． 正常實(shí)驗(yàn)兔及NAFLD肝臟的CT灌注表現(xiàn)及參數(shù)比較

圖2 CT灌注成像正常實(shí)驗(yàn)兔及NAFLD實(shí)驗(yàn)兔的肝動(dòng)脈、門靜脈、肝臟、脾臟時(shí)間-密度曲線。A．正常實(shí)驗(yàn)兔的肝動(dòng)脈、肝臟時(shí)間-密度曲線；B．NAFLD組實(shí)驗(yàn)兔的肝動(dòng)脈、肝臟時(shí)間-密度曲線；C．正常實(shí)驗(yàn)兔的門脈及脾臟時(shí)間-密度曲線；D．NAFLD組實(shí)驗(yàn)兔的門脈及脾臟時(shí)間-密度曲線（紅色：肝動(dòng)脈；黃色：肝實(shí)質(zhì)；藍(lán)色：門靜脈；綠色：脾臟）。

CT灌注成像顯示正常對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)兔肝實(shí)質(zhì)時(shí)間密度曲線（time density curve， TDC）呈速升平臺(tái)型（圖2A），NAFLD組肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化峰值時(shí)間較正常組延長(zhǎng)，肝實(shí)質(zhì)時(shí)間密度曲線呈緩升平臺(tái)型（圖2B），正常對(duì)照組脾臟時(shí)間密度曲線呈速升緩降型（圖2C），NAFLD組脾臟強(qiáng)化程度減低，時(shí)間密度曲線呈緩升平臺(tái)型（圖2D）。

表1 非酒精性脂肪肝病NAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔肝臟以門靜脈灌注為主，肝動(dòng)脈灌注量較小，高脂飲食組實(shí)驗(yàn)兔肝臟的門靜脈灌注量減低，肝動(dòng)脈灌注量增加，肝動(dòng)脈供血比增高。不同組間（正常對(duì)照組與Borderline組、NASH組）的ALP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0．858，P=0．432），BF、BV、PVP及HPI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Welch或 F 值分別為 5．113，6．733，9．107 和 41．160，P值分別為 0．017，0．003，0．002 和 0．000），經(jīng)用 LSD或Duntte’s T3方法進(jìn)行多重比較，Borderline組的BV較正常對(duì)照組減低（P＜0．05），Borderline、NASH組的BF、PVP較正常對(duì)照組減低，HPI升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05），但Borderline組和NASH組的BF、BV、PVP、HPI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0．05）（表3）。

討 論

國(guó)內(nèi)外有很多研究在NAFLD的診斷和嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)，治療方法等方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)。目前肝活檢穿刺仍是診斷NAFLD和NASH的參考標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)性檢查方法，且采樣時(shí)存在一定的誤差，有可能影響分期的準(zhǔn)確性或?qū)е抡`診，所以，該方法并不適用于所有患者[4，7-9]。此外，由于治療NAFLD的關(guān)鍵在于減緩或者逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化的進(jìn)程，因而評(píng)價(jià)患者的療效非常重要，顯然肝活檢不是理想的隨訪檢查方法[9]。

表2 正常組及Borderline組、NASH組的肝臟CT值及肝臟/豎脊肌CT比值的比較

表3 正常組、Borderline組與NASH組實(shí)驗(yàn)兔的肝臟CTP參數(shù)比較

目前診斷脂肪肝的無創(chuàng)性檢查手段很多，如臨床生化指標(biāo)、超聲（ultrasonography， USG）、CT平掃、磁共振雙回波（dual-echo in-phase and opposedphase，IP/OP）及磁共振波譜（MR spectroscopy，MRS）技術(shù)。

由于CT對(duì)組織的密度分辨率較高，也是脂肪肝定量評(píng)價(jià)的常用檢查方法之一[10]。大量研究表明肝臟CT值或肝脾CT值的比值與肝臟脂肪含量有較高的相關(guān)性，提示CT是進(jìn)行脂肪肝定量診斷的一種重要影像學(xué)方法。目前CT診斷脂肪肝的主要標(biāo)準(zhǔn)為肝臟密度普遍降低，肝臟/脾臟的CT值之比＜1．0。肝臟/脾臟CT比值介于0．7和1．0之間者為輕度，介于0．5和0．7之間者為中度，＞0．5者為重度脂肪肝[3]。

本研究的CT平掃結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)兔肝臟的CT值和肝臟/豎脊肌CT值比值均表現(xiàn)為隨高脂飲食時(shí)間或病變程度進(jìn)行性下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，盡管有學(xué)者[11]認(rèn)為CT對(duì)肝臟輕度脂肪變性不敏感，不適合評(píng)價(jià)NAFLD，但本研究NAFLD模型組實(shí)驗(yàn)兔均可檢測(cè)到肝臟CT值的變化，所以我們認(rèn)為CT平掃可做為定量評(píng)價(jià)NAFLD中肝臟脂肪變性嚴(yán)重程度的檢查方法之一。

肝臟CT灌注掃描主要應(yīng)用于肝臟局灶性疾病如肝細(xì)胞癌的診斷，以及腫瘤治療后的療效評(píng)價(jià)[12-13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，某些肝臟的局灶性病變或門靜脈血栓等，也可出現(xiàn)肝臟一過性的區(qū)域性灌注異常。近年來，有學(xué)者開始將其應(yīng)用于肝硬化等肝臟彌漫性疾病的診斷。CTP可顯示肝臟血流動(dòng)力學(xué)的改變，包括肝臟的血流灌注下降，肝動(dòng)脈灌注指數(shù)增加，以及平均通過時(shí)間（mean trasnsimittion time， MTT）延長(zhǎng)等[13]。其病理基礎(chǔ)為正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，新生小葉結(jié)構(gòu)紊亂、扭曲，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)纖維化及結(jié)節(jié)再生，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（sinusoidal endothelial cells， SEC）的失窗孔以及Disse腔膠原沉積等，使得肝血竇血流受阻，從而導(dǎo)致肝臟區(qū)域或整體灌注量下降[12-13]。HPI增加的可能機(jī)制是由于門靜脈血流減少，肝動(dòng)脈血流代償性增加，即所謂的肝動(dòng)脈緩沖效應(yīng)( hepatic arterial buffer response， HABR)[14]。

目前，尚未見CTP應(yīng)用于NAFLD的研究。首先，我們觀察到，NAFLD模型組的肝臟實(shí)質(zhì)及脾臟的TDC和正常對(duì)照組不同。正常對(duì)照組的肝實(shí)質(zhì)TDC呈速升平臺(tái)型，NAFLD模型組的肝實(shí)質(zhì)TDC呈緩升平臺(tái)型，爬升斜率變小，正常對(duì)照組的脾臟TDC與門靜脈TDC平行，呈速升緩降型，而NAFLD脾臟的TDC低平呈緩升平臺(tái)樣改變，我們認(rèn)為，這是由于NAFLD導(dǎo)致肝血竇狹窄后繼發(fā)門靜脈阻力增加，肝實(shí)質(zhì)門脈灌注下降及脾靜脈回流受阻。所以，肝、脾臟TDC的改變實(shí)際上間接反應(yīng)了NAFLD所致門脈壓力的升高。

我們的結(jié)果表明，NFALD的CTP參數(shù)出現(xiàn)了與肝硬化類似的變化，NFALD模型組的BF、BV均較正常對(duì)照組減低，提示肝臟微循環(huán)灌注及血池容量下降。PVP明顯減低，而HPI明顯增高則提示類似肝硬化的肝動(dòng)脈緩沖效應(yīng)。這一結(jié)果說明，盡管NAFLD的基本病理改變與肝硬化不同，但都會(huì)導(dǎo)致肝血竇受壓、變窄，使肝臟血流動(dòng)力學(xué)出現(xiàn)相似的改變，肝臟微循環(huán)灌注量減低。而肝臟微循環(huán)灌注減低必然影響各種物質(zhì)包括脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，反過來加重肝臟脂肪變性及炎癥，兩者互為因果，互相促進(jìn)，導(dǎo)致肝臟病變進(jìn)展。本研究中，盡管NAFLD模型組的ALP有較正常對(duì)照組升高的趨勢(shì)，但是兩組之間沒有顯著性差異，這可能與該參數(shù)的重復(fù)性較差有關(guān) 。此外，BF、BV、PVP和HPI在Borderline和NASH組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CTP參數(shù)在判斷NAFLD病變嚴(yán)重程度上欠佳。

實(shí)際上，已有學(xué)者認(rèn)識(shí)到NAFLD可能會(huì)導(dǎo)致肝臟微循環(huán)的障礙，并開始應(yīng)用彩色多普勒評(píng)價(jià)NAFLD的血流動(dòng)力學(xué)改變。其結(jié)果表明，NAFLD患者的門靜脈最大流速（peak portal vein velocity，PPVV），平均血流速度（mean portal vein velocity， MPVV）及肝動(dòng)脈阻力指數(shù)（hepatic artery resistance index，HARI）減低。并且肝臟脂肪變程度越重，PPVV、MPVV以及HARI減低越明顯。此外，肝靜脈頻譜形態(tài)呈現(xiàn)的波峰減少與肝纖維化的進(jìn)程相一致，呈衰減型或平坦型[15]。所以，本研究NAFLD模型的CTP參數(shù)以及肝、脾TDC的變化與彩色多普勒的發(fā)現(xiàn)相符合，即NAFLD在肝脂肪變性和/或脂肪性肝炎的基礎(chǔ)上，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生了顯著的變化，門靜脈灌注減低。

非酒精性脂肪肝病實(shí)驗(yàn)兔的肝臟CTP中的BF、BV出現(xiàn)下降，門脈灌注量PVP明顯下降，同時(shí)出現(xiàn)HPI增高，提示NAFLD微循環(huán)灌注下降后，可出現(xiàn)類似于肝硬化的肝動(dòng)脈緩沖效應(yīng)。