陳淑吟，張志勇，吉紅九，李 鵬，趙永超，張志偉

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023）

鈣調(diào)蛋白也稱鈣調(diào)素（calmodulin，CaM），是真核細(xì)胞中最重要的 Ca2＋結(jié)合蛋白［1－2］。作為Ca2＋信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，CaM介導(dǎo)調(diào)控由Ca2＋引起的一系列生理生化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞增殖、神經(jīng)傳導(dǎo)、激素分泌、基因表達(dá)等重要的生理過程具調(diào)節(jié)功能［3－6］。關(guān)于CaM基因與物種的生長、生殖等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的研究已有不少報(bào)道，如CaM基因座可能是影響京海黃雞新品種產(chǎn)蛋數(shù)和蛋殼質(zhì)量性狀重要候選基因［7］；CaM與三疣梭子蟹（Portunus trituberculatu）生長蛻皮［8］有密切關(guān)系；參與對(duì)貝類外殼形成的調(diào)控［9－11］，CaM一些位點(diǎn)突變對(duì)長牡蠣（Crassostrea gigas）貝殼重有顯著性影響［12］；CaM的上調(diào)表達(dá)與魚類的抗寒能力有關(guān)［13］；RNAi實(shí)驗(yàn)顯示出CaM對(duì)血吸蟲（Schistosoma mansoni）幼蟲早期發(fā)育的 重 要 作 用［14］。此 外，在 赤 點(diǎn) 石 斑 魚（Epinephelus akaara）雌性轉(zhuǎn)雄性過程中，CaM是促使性轉(zhuǎn)變的重要功能基因之一［15］；莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）體內(nèi)的類固醇生成受 Ca2＋／CaM調(diào)節(jié)［16］。這些研究表明 CaM基因在物種的生長發(fā)育與性腺發(fā)育等過程中扮演重要作用。

真鯛 （Pagrus major）、黑鯛 （Acanthopagrus schlegelii）分別為鯛科（Sparidae）的赤鯛屬和棘鯛屬中名貴經(jīng)濟(jì)魚類，黑鯛肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美又有較好抗逆性，真鯛生長速度快且體色靚麗，均是中國不同海區(qū)的重要養(yǎng)殖對(duì)象［17－18］。為選育優(yōu)良海水養(yǎng)殖新品種，利用黑鯛與真鯛進(jìn)行的雜交育種已有不少研究［19－21］；關(guān)于黑鯛、真鯛及雜交子代（F1）的核型、遺傳相似性、抗逆性或營養(yǎng)成分比較等方面已有一些報(bào)道［22－25］，而尚未有從功能基因上進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。近年來，通過篩選出與雜種優(yōu)勢(shì)形成有關(guān)的基因，揭示基因表達(dá)差異正成為探尋雜種優(yōu)勢(shì)分子機(jī)理新的切入點(diǎn)［26］。由黑鯛（♂）×真鯛（♀）中得到的雜交子代F1（AP），1～2齡魚的生長速度已顯示了較好的雜種優(yōu)勢(shì)。本文首次克隆了APCaM和PmCaM基因序列，并借助于功能基因分析，研究了兩基因序列差異水平及其表達(dá)模式，為CaM基因功能研究及鯛科魚類育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)用魚均來自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所人工繁育及養(yǎng)殖。其中，雜交F1與真鯛的仔魚樣本為同樣室內(nèi)條件下培育的30日齡仔魚，雜交F1仔魚體長、體質(zhì)量分別為（1.10±0.01）cm、（0.040±0.001）g，真鯛仔魚體長、體質(zhì)量分別為（0.98±0.01）cm、（0.039±0.001）g；成魚樣本取自同一口池塘混合養(yǎng)殖、隨機(jī)選取的2齡健康個(gè)體，雜交F1成魚體長、體質(zhì)量分別為（25.15±0.06）cm、（472.1±53.8）g，真鯛成魚體長、體質(zhì)量分別為（23.82±0.15）cm、（376.81±26.8）g。

因仔魚樣本個(gè)體太小，仔魚取整體和成魚的腦、肌肉、鰓、肝、腎、性腺等組織約5～15 mg分別放入裝有RNAlater RNA Stabilization Reagent（QIAGEN）的1.5 mL離心管內(nèi)，并用滅菌后的小號(hào)剪刀剪成粒徑小于0.2 mm碎粒，置于4℃冰箱（海爾BCD-649WE）過夜，然后轉(zhuǎn)20℃保存?zhèn)溆?。用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）分別提取仔魚和成魚組織樣本的總RNA。通過分光光度計(jì)（Eppendorf）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度和純度。使用 PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RR047A試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。

1.2 APCaM與PmCaM基因cDNA全長序列克隆

采用已知的魚類CaM基因的序列設(shè)計(jì)、合成擴(kuò)增 CaM序列簡并引物 CaMF／CaMR（表1），以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行基因中間片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）包括：25μL 2×Ex-Taq Buffer（TaKaRa），1μL dNTP Mix（10 mM），15μL無菌水，1μL Taq DNA聚合酶（5 units·μL－1），3 μL簡并引物（10μM）和 5μL cDNA，最后用50 μL礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)條件如下：94℃4 min預(yù)變性；然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min；35個(gè)循環(huán)；72℃額外擴(kuò)展10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠分離檢測(cè)，用已經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物克隆入pMD18－T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TaKaRa），經(jīng)PCR驗(yàn)證后取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)克隆獲得的CaM基因中間片段，設(shè)計(jì)并合成 5′-RACE和3′-RACE基因特異引物 GSPAPCaM5′、GSP-PmCaM5′、GSP-APCaM3′、GSPPmCaM3′（表 1）。用 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen）及SMARTer RACE cDNA Amplification Kit試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用設(shè)計(jì)特異引物與通用引物配合進(jìn)行PCR，擴(kuò)增APCaM與PmCaM的5′－端及3′端cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、克隆、驗(yàn)證及測(cè)序列等步驟后，獲得該基因的5′端及3′端序列。應(yīng)用DNAStar Lasergene 7.1軟件，分別組裝APCaM與PmCaM基因的5′-RACE片段、中間片段和 3′-RACE片段，拼接生成APCaM與PmCaM基因的cDNA全長序列。

表1 CaM基因cDNA片段擴(kuò)增與熒光定量PCR的引物與擴(kuò)增片段長度Tab.1 Primers used for CaM genes cloning and the length of PCR amplifications

1.3 APCaM與PmCaM基因與蛋白的序列分析

CaM基因cDNA的開放閱讀框（open reading frame，ORF）查找用 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／）。分子量與理論等電點(diǎn)預(yù)測(cè)采用ExPASy在線服務(wù)器的Compute pI／Mw工具 （http：／／www.expasy.org／tools／pi＿tool.html）。結(jié)構(gòu)域分析及Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)使用NCBI Conserved domains（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure）。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析采用 SignalP（www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）［27－28］。CaM的亞細(xì)胞定位采用 PSORTⅡ軟件（http：／／psort.ims.u-tokyo.ac.jp／form2.html）。CaM的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)使用 TMHMM Server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）。潛在的糖基化位點(diǎn)使用 Asn-X-Ser／Thr工具進(jìn)行預(yù)測(cè)（http：／／cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）。磷酸化位點(diǎn)分析使用 NetPhos 3.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用DNAman軟件。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用 SWISSMODEL 服 務(wù) 器 （http：／／www.expasy.org／swissmod／SWISS-MODEL.html）［29］。APCaM與PmCaM基因全長cDNA序列比對(duì)使用clustalX軟件；序列的同源性分析及CaM基因的氨基酸序列相似性搜索，采用在NCBI網(wǎng)站運(yùn)行BLAST程序［30］。

1.4 APCaM與PmCaM基因的mRNA表達(dá)差異分析

根據(jù)已得到的APCaM與PmCaM基因全長cDNA序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物APCaM F／APCaM R和PmCaM F／PmCaM R（表2），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。內(nèi)參基因引物為actin F／actin R（表2）。通過 IO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定CaM基因在AP與Pm不同組織樣本中的表達(dá)情況。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，以各樣本的cDNA為模板，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，58℃變性20 s，72℃變性20 s，75℃ 變性5 s并采集熒光信號(hào)；40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線生成程序：95℃到65℃每降0.5℃（5 s）采集一次熒光。樣品和內(nèi)參均設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用溶解曲線分析產(chǎn)物專一性，結(jié)果用2-ΔΔCT法進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)的差異性。

表2 熒光定量PCR引物Tab.2 Primers used for fluorescence real-time quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 APCaM與PmCaM基因cDNA全長序列的克隆與分析

以設(shè)計(jì)的簡并引物擴(kuò)增獲得365bp的CaM基因中間片段，再以此片段設(shè)計(jì)基因的5′及3′引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序等步驟，獲得APCaM和PmCaM的5′及3′序列，軟件拼接獲得APCaM與PmCaM的cDNA片段長度分別為1 230 bp和1 210 bp；cDNA全長序列經(jīng)BLAST比對(duì)驗(yàn)證均屬CaM基因。其中，APCaM基因的全長cDNA序列具有一個(gè)450 bp（從序列的96 bp至545 bp處）的開放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)具149個(gè)氨基酸的多肽；具有一個(gè) 95 bp的 5′－非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），3′-UTR長度為 685 bp，包含有 AATAA加尾信號(hào)及 poly（A）尾巴；APCaM基因序列中A＋T和C＋G的百分比分別為56.75%和43.25%。PmCaM基因的全長cDNA序列ORF長度同為450 bp（從序列的97 bp至546 bp處），編碼的多肽同為149個(gè)氨基酸；5′-UTR長度比 APCaM多 1bp，3′-UTR長度比APCaM少21 bp，同樣包含有AATAA加尾信號(hào)及poly（A）尾巴（圖1）；基因序列中 A＋T和 C＋G的百分比分別為56.20%和43.80%。

圖1 真鯛PmCaM基因的cDNA全長序列和推導(dǎo)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmCaM gene from Pagrus major注：推導(dǎo)的氨基酸序列顯示在對(duì)應(yīng)的核苷酸序列下方；起始密碼子與終止密碼子用紅色標(biāo)注，5′RACE引物用綠色標(biāo)注，3′RACE引物用藍(lán)色標(biāo)注，N－糖基化位點(diǎn)用加粗下劃線標(biāo)注，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)加粗標(biāo)注，十四烷基位點(diǎn)用陰影標(biāo)注，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)用方框標(biāo)注Notes：Translated aminoacid sequenceisshown under nucleotide sequence and in bold character；initial codon and terminal codon are marked in red，5′RACE primers in green thin under line，3′RACE primers in blue and thick underline，N-glycosylation site marked with bold underline，protein kinase C phosphorylation site bolded，myristyl with shadow marking and double underline，Casein kinase II phosphorylation site marked with box

對(duì)基因的氨基酸motif搜索表明APCaM與PmCaM都含有4個(gè) EF-hand結(jié)構(gòu)域（EF-hand calcium-binding）；多肽鏈都含有1個(gè)N端糖基化（Asn糖基化）位點(diǎn)，5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinaseⅡ，CK2）磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)十四烷基位點(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（圖1）。

APCaM與PmCaM的ORF序列有7個(gè)堿基差異，分別為 C／T，C／G，C／A，A／T，G／A；兩基因蛋白多肽有5個(gè)氨基酸差異（圖2），分布在第70、105、117、124及 131位點(diǎn)。序列同源相似性搜索比對(duì)得出，APCaM與PmCaM基因在核苷酸水平與其它魚類CaM基因相似性最高達(dá)95%（表 3）；APCaM基因與墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus，XP＿022517811.1）、大西洋鯡（Clupea harengus，XP＿012679224.1）及底鳉（Fundulus heteroclitus，XP＿012724361.2）等魚類僅有一個(gè)氨基酸差異，相似性達(dá)99%，PmCaM基因與這些魚類有4～5個(gè)的氨基酸位點(diǎn)差異，相似性為97%。基因比對(duì)結(jié)果說明APCaM和PmCaM都屬于CaM基因家族，也反映了CaM基因序列的高度保守。另外，雜交F1的APCaM和黑鯛父本（As）該基因AsCaM已知序列比較，長度同樣是149個(gè)氨基酸的蛋白多肽，兩序列在第124位點(diǎn)有一個(gè)氨基酸不同（K-E），見圖2，此差異程度明顯小于雜交F1與真鯛母本的。

2.2 APCaM與PmCaM蛋白質(zhì)基本屬性與功能結(jié)構(gòu)分析

對(duì)兩種鈣調(diào)蛋白理化性質(zhì)分析得出，APCaM蛋白分子量約為16.84 kDa、理論等電點(diǎn) pI為4.15，脂肪系數(shù)為65.50，分子式為C720H1134N190O254S10；PmCaM蛋白分子量約為16.80 kDa、理論等電點(diǎn)pI為4.10，脂肪系數(shù)為61.54，分子式為 C719H1129N189O256S10。在組成APCaM與PmCaM兩種蛋白的18種氨基酸中，谷氨酸（Glu）所占的比例最高，達(dá)到13.4%，組氨酸（His）所占的比例最低，為0.7%。APCaM與PmCaM蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)略有差異，分別為29.83與 28.21，根據(jù) GRP（Guruprasad-Reedy-Pandit）方法得出兩者均屬蛋白穩(wěn)定。親水性檢測(cè)得出GRAVY分別為－0.656（APCaM）與－0.653（PmCaM），均具親水性。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果說明兩蛋白屬非分泌型蛋白。PSORTⅡserver分析得出蛋白的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞之中的可能性最大為52.2%；子程序NNCN預(yù)測(cè)分析表明兩CaM蛋白94.1%可能性定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 APCaM與PmCaM、AsCaM蛋白氨基酸序列差異比較Fig.2 Alignment of APCaM with PmCaM and AsCaM amino acids sequences注：陰影表示相同氨基酸Notes：Consistency sequences are presented by shadow

表3 雜交F1和親本的CaM與其它魚類CaM基因序列的同源性比較Tab.3 Blastn homology search results of CaM gene sequence with other fishes

圖3 雜交子代APCaM與真鯛PmCaM預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（a）、功能域（b）及三維結(jié)構(gòu)（c）Fig.3 Predicted results of the secondary structure（a），domains（b）and the predicted three-dimensional structure（c）of CaM protein search from Pagrus major（Pm）and the hybrids F1（AP）of Acanthopagrus schlegelii（♂）×Pagrus major（♀）注：（b）-Pm中箭頭所示為兩基因氨基酸差異位點(diǎn)Notes：Arrowhead of the（b）-Pm indicates different amino acids loci of two genes

對(duì)APCaM和PmCaM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3－a所示，其中，helix表示α螺旋（黑線），strands表示延伸鏈（藍(lán)線），coil表示無規(guī)則卷曲（紅線）；蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分以α螺旋為主，占61.74% ＞45.00%，無規(guī)則卷曲占32.89%，屬不完全α型蛋白。兩CaM基因的4個(gè)EF-hand功能結(jié)構(gòu)域有16個(gè)Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)，見圖3－b。兩基因的蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果空間結(jié)構(gòu)相似、保守，在不規(guī)則卷曲略有不同（圖3－c），CaM均由N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（又稱N-lobe和C-lobe）通過一個(gè)中間linker連接組成，包括7個(gè)α螺旋，且α螺旋相對(duì)位置都很保守。

2.3 CaM基因的mRNA差異表達(dá)分析

定量分析得出CaM基因在仔魚及成魚6種組織中均有表達(dá)（圖4），表達(dá)水平在不同的品種、生長階段及組織中均存在明顯差異，且有較強(qiáng)的組織特異性；表達(dá)量較高的為腦與性腺，肝及腎中的表達(dá)量較低。基于SPSS19.0軟件分析得出，雜交 F1中，APCaM在腦組織的表達(dá)量（19.44）與其它組織相比有極顯著性高表達(dá)（P＜0.001）；肌肉、鰓及性腺的組織間表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05），但其與肝、腎的低表達(dá)比較呈極顯著差異（P＜0.01）。真鯛中，PmCaM在性腺的表達(dá)水平（7.51）與其它組織相比均有極顯著高表達(dá)（P＜0.001），腦與鰓組織間的表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05），但其與肝、腎和肌肉中的表達(dá)量有極顯著差異（P＜0.01），肝、腎和肌肉中的表達(dá)量較低且不存在顯著差異。雜交F1APCaM與真鯛PmCaM相比，兩種仔魚CaM的表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）；在6個(gè)檢測(cè)組織中，腦、性腺及肌肉3種組織中CaM表達(dá)量存在極顯著差異（P＜0.001），其中，APCaM在腦及肌肉中的表達(dá)量極顯著高于PmCaM，而在性腺中的表達(dá)量極顯著的低于PmCaM的水平，鰓中CaM的表達(dá)水平顯著差異（P＜0.05），成魚的肝、腎中的基因表達(dá)沒有顯著差異（P＞0.05）。黑鯛親本中，已知AsCaM在性腺中表達(dá)水平（7.49）顯著高于腦（5.26）和仔魚（4.92）（P＜0.05），極顯著高于肝、腎、鰓及肌肉組織（P＜0.01），肝、腎、鰓與肌肉組織間不存在明顯差異表達(dá)［32］。雜交F1和黑鯛父本相比，兩者仔魚CaM的表達(dá)水平有極顯著差異（P＜0.01），APCaM在仔魚中的表達(dá)量相對(duì)較低；在檢測(cè)的6種組織中，鰓中CaM的表達(dá)水平顯著差異（P＜0.05），APCaM的表達(dá)水平高于AsCaM的，其它組織中雜交 F1與黑鯛父本的CaM表達(dá)情況，與在真鯛中的差異水平基本一致（圖3）。

圖4 CaM在雜交子代與親本中的定量表達(dá)差異比較Fig.4 Relative expression results in various tissues of CaM in the hybrid and parents注：數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；垂線段表示標(biāo)準(zhǔn)差Notes：Values are expressed as mean±sd.Uprightness line mark standard deviation

3 討論

隨著對(duì)鈣調(diào)蛋白功能重要性的認(rèn)識(shí)加深，CaM成為真核細(xì)胞內(nèi)所有Ca2＋結(jié)合蛋白中研究得最為透徹的一類［32－35］。越來越多的CaM基因在動(dòng)物、植物、真菌和原生動(dòng)物中被分離和克隆出來［36］。不同物種的CaM序列結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上呈很強(qiáng)的保守性［37－38］，研究表明動(dòng)植物間的 CaM基因氨基酸序列的相似度在90%以上［12］，脊椎動(dòng)物中有些種類的CaM氨基酸水平完全一致［39］。本研究得到的雜交子代APCaM或真鯛PmCaM氨基酸序列與許多其它魚類的相似性分別達(dá)99%或97%，兩基因的ORF區(qū)域編碼149個(gè)氨基酸的序列長度及包含有4個(gè)EF-hand的結(jié)構(gòu)域，與牙鲆（Paralichthys olivaceus）PoCaM、點(diǎn)帶石斑魚 （Epinephelus coioides）EcCaM、花刺參（Stichopus monotuberculatus）StmCaM及扶桑綿粉蚧（Phenacoccus solenopsis Tinsley）PsCaM 等的ORF區(qū)域一致［39－43］。

本研究得到的APCaM與PmCaM基因之間相差5個(gè)氨基酸位點(diǎn)，其差異程度不小于種間水平，例如，花刺參 CaM與中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）CaM相比只有 3個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變換，與合浦珠母貝（Pinctada martensii）相比也僅為4個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變換［40］。有研究表明CaM基因不同亞型的差異部位可能只存在于非編碼區(qū)［44］，包括魚與哺乳動(dòng)物間的CaM差異位點(diǎn)也主要在3′-UTR［45］?；虻?′-或3′-UTR可以獨(dú)自或者協(xié)同作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)［46］，也可以啟動(dòng)基因的組織特異性表達(dá)［47］。實(shí)際上，這些非編碼DNA才是遺傳的中心，正是由它們決定基因何時(shí)何地何量表達(dá)，以及如何高效生產(chǎn)出各種蛋白質(zhì)［48－49］。APCaM與 PmCaM基因間的3′-UTR還存在21 bp的插入缺失差異，在真鯛母本與雜交子代F1間，是否有導(dǎo)致功能性狀變化的效果，還有待于更多詳細(xì)研究。

定量分析表明，CaM基因在仔魚及成魚所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，在雜交子代與親本間的表達(dá)存在明顯不同之處，其中，雜交F1APCaM在腦及肌肉中有極顯著的高表達(dá)，在性腺中是極顯著的低表達(dá)，而在仔魚期及成魚的鰓中表達(dá)水平處于父、母本的中間。真鯛及黑鯛親本中，均是性腺的CaM表達(dá)量最大，其次是腦。雜交F1中，APCaM在腦中的表達(dá)量最高，其次是肌肉組織，在性腺中的表達(dá)處于中間水平。相關(guān)研究表明CaM在脊椎動(dòng)物腦中的含量最豐富［50］；CaM表達(dá)對(duì)神經(jīng)元的生長和發(fā)育起著重要作用［51］。CaM依賴的蛋白質(zhì)激酶就是神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要激酶［41］。大腦是動(dòng)物機(jī)體的重要生命中樞，說明CaM在維持大腦正常功能中具有重要作用。CaM基因在腦中的超高表達(dá)，有助于促進(jìn)下丘腦－垂體－生長軸相關(guān)基因表達(dá)來提高生長性能。關(guān)聯(lián)到雜交F1的雜種生長優(yōu)勢(shì)，推測(cè)APCaM與PmCaM、AsCaM相比在腦、肌肉中的極顯著性高表達(dá)可能與生長優(yōu)勢(shì)有關(guān)?；虻母弑磉_(dá)量為雜種優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn)［26］。借助NRK細(xì)胞模型研究得出，高表達(dá)鈣調(diào)素加速細(xì)胞的生長［52］。相反，就低表達(dá)情況而言，APCaM相比于PmCaM及AsCaM在性腺中表達(dá)呈極顯著差異，樣本解剖及性腺切片結(jié)果表明，其生殖細(xì)胞發(fā)育明顯滯后于親本，且雜交 F1的2齡魚性腺指數(shù)（gonadosomatic index）僅約為同期真鯛或黑鯛的1／3；這一結(jié)果也證明CaM可能參與性腺發(fā)育的調(diào)控過程［11，27］。對(duì)四川白鵝CaM表達(dá)量研究也表明該基因在大腦組織中也顯著高于其它組織，并且CaM可能通過影響卵泡細(xì)胞增殖和類固醇激素合成來參與調(diào)控動(dòng)物繁殖［53］。類似于APCaM在雜交F1的腦及性腺中的這種表達(dá)量超高或低于雙親表達(dá)量范圍的情況，有研究關(guān)注并認(rèn)為這種新的基因表達(dá)模式是導(dǎo)致雜種優(yōu)勢(shì)的原因［26］。雜交F1的這種性狀態(tài)勢(shì)一定程度上體現(xiàn)了魚類屬間雜交導(dǎo)致的可育性的不確定，也是基因調(diào)控的結(jié)果；再者可能是由于生長與生殖在一定程度上有互為負(fù)調(diào)控的關(guān)系。魚類的鰓為與細(xì)胞免疫相關(guān)的器官［37］，在鰓組織中 APCaM顯著性低于PmCaM的表達(dá)，可能也與雜交F1的免疫水平相對(duì)低于真鯛的情況相關(guān)，這也是該育種研究需進(jìn)一步探索的內(nèi)容。

另外，不同魚類CaM的表達(dá)情況多種多樣，有與本研究得到的基因表達(dá)結(jié)果相似的，也有明顯不同的，如青島文昌魚（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）在鰓及性腺中均是高表達(dá)［41］，本研究的結(jié)果與之相近；七鰓鰻（Lampetra japonica）主要在腸、鰓、髓及腎中表達(dá)，而心、肝組織中幾乎不表達(dá)［37］，本文中真鯛及雜交F1的肝中均有表達(dá)，但表達(dá)量較低，而點(diǎn)帶石斑魚的肝為高表達(dá)［43］；赤點(diǎn)石斑魚的腦、心、肝、脾及腎中均有表達(dá)，且在精巢中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)最弱［15］，而雜交F1的肌肉有較高表達(dá)量。從這些研究表明，CaM的表達(dá)水平只隨魚類品種不同、生長階段不同而有不一樣的結(jié)果，總體來說，在魚體主要器官組織中多有較高表達(dá)，尤其在腦及性腺中的表達(dá)水平更顯著。這些結(jié)果加深了對(duì)CaM基因調(diào)控魚類的生長及性腺發(fā)育等作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。