馮天龍，黃靈芳，許翔鴻，張 勉

(中國藥科大學 生藥學研究室，江蘇 南京 211198)

中藥百部為百部科植物直立百部 [Stemonasessilifolia(Miq.) Miq. ]、蔓生百部 [S.japonica(Bl.) Miq. ]或?qū)θ~百部 (S.tuberosaLour.)的干燥塊根，是歷版《中國藥典》收載的傳統(tǒng)止咳、殺蟲中藥[1]。百部主要活性成分為結(jié)構(gòu)特異的百部生物堿，迄今已分離得到200余種該類生物堿[2-3]。百部藥材化學成分多樣[4-5]，不僅3種不同基原百部的成分差異極大[6]，就是同種基原百部的生物堿種類也變異很大[7]，難以找到共有成分以建立質(zhì)量標準。

為了了解百部商品藥材的現(xiàn)狀，本課題組歷時多年從全國各地收集了83批的百部藥材，對其進行了基原鑒定，改進了前人的提取和色譜條件[6-7]，采用簡易的等度洗脫HPLC-ELSD方法測定了金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿的含量，并對4種生物堿在百部藥材中的分布進行了分析。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(含G1311B型四元泵，G1329B型自動進樣器，美國安捷倫公司)；Alltech 3300 ELSD檢測器；十萬分之一、萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；KUBOTA 3700微量冷凍離心機(日本久保田公司)。

1.2 實驗材料

83批百部藥材購自全國各地藥材市場與藥房，經(jīng)作者鑒定均為百部科植物對葉百部 (StemonatuberosaLour.)的干燥塊根。金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿、對葉百部堿均由課題組分離得到，經(jīng)HPLC歸一法測得金剛大堿、新對葉百部堿和對葉百部堿純度均≥98%，百部新堿純度≥91%(極不穩(wěn)定)。甲醇(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液制備

精密稱取金剛大堿(JGD)、百部新堿(BBX)、新對葉百部堿(XDY)、對葉百部堿(DY)適量，配置成濃度為1.095、1.161、1.100和1.072 mg/mL的對照品儲備液。將對照品儲備液稀釋2倍，制成對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取對葉百部藥材粉末(過60目篩)0.5 g，置50 mL離心管中，加入88%甲醇19 mL，密封，超聲提取25 min，重復兩次，離心取上清，合并旋干，殘渣以少量甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相為0.1%三乙胺(A)-甲醇(B) (43∶57)，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30℃。ELSD檢測器漂移管溫度80 ℃，氮氣流速2.1 mL/min，增益為8。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密稱取配制好的4種生物堿對照品儲備液，依次稀釋成系列濃度，進樣、測定峰面積。以溶液濃度(M)的對數(shù)值為橫坐標，以峰面積(Y)的對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，計算各成分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。金剛大堿回歸方程為LgY=1.485 7 LgM+4.043 9，線性范圍0.034～1.095 mg/mL，R=0.999 6；百部新堿回歸方程為LgY=1.571 7 LgM+ 4.020 5，線性范圍0.036～1.161 mg/mL，R=0.999 9；新對葉百部堿回歸方程為LgY=1.452 5 LgM+ 4.122 5，線性范圍0.034～1.100 mg/mL，R=0.999 7；對葉百部堿回歸方程為LgY=1.697 2 LgM+ 4.173 4，線性范圍0.034～1.072 mg/mL，R=0.999 7。4個生物堿在所研究的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度、穩(wěn)定性和重復性

按照常規(guī)方法進行試驗，其RSD均符合要求。

2.4.3 加樣回收率

分別精密稱取已知金剛大堿含量的同一藥材樣品和已知百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿含量的同一藥材樣品各6份，每份0.25 g，分別加入與其含量等量的4種生物堿對照品，平行制備供試品溶液，按2.3項下的色譜條件測定。研究結(jié)果表明，金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿的平均回收率為99.2%、101.0%、98.3%和98.5%，RSD分別為4.16%、3.65%、3.30%和3.94%。

3 實驗結(jié)果與討論

百部由于自身所含化學成分的多變性，難以制定統(tǒng)一的質(zhì)量標準，因此歷版《中國藥典》包括2015年版“百部”項下均未包括“含量測定”項。本課題組多年來收集了來自全國各地的83批百部商品藥材，時間跨度從2011—2017年，應(yīng)該具有一定的代表性。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)其基原均為對葉百部，說明對葉百部可能是目前市場上百部類藥材的唯一基原。本論文在前人研究基礎(chǔ)上，改進了方法，測定了對葉百部中4個主要成分的含量。

3.1 對葉百部藥材中4種生物堿的含量

按照建立的方法對83批對葉百部藥材中金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿的含量進行了測定，測定結(jié)果見圖1和表1。含量測定結(jié)果顯示，含有金剛大堿的藥材27批，含量為1.19～9.13)mg/g，平均含量為1.98 mg/g；含有百部新堿的藥材48批，含量為1.41～12.48 mg/g，平均含量為4.75 mg/g；含有新對葉百部堿藥材22批，含量為1.27～8.87 mg/g，平均含量為3.73 mg/g；含有對葉百部堿藥材48批，含量為2.12～13.83 mg/g，平均含量為5.34 mg/g；4種生物堿含量的總和為1.41～13.83 mg/g，平均總含量為7.47%。

由此可見，除金剛大堿外，其余3種生物堿的含量呈現(xiàn)兩極分化，由于少數(shù)高含量藥材的存在，使4種生物堿總和的平均值(7.47%)遠高于各單一生物堿的平均含量。若采用4種生物堿總和平均值下浮20%(5.98 mg/g)進行質(zhì)控，約1/3的藥材低于該含量，包括較多含量在5.0 mg/g左右的僅含單一生物堿的藥材，因此即使采用多種生物堿總和的方法來制定百部藥材的含量標準也不合理。

A為4個對照品；B-C分別為樣品S62、S10；1-金剛大堿，

表1 對葉百部中金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿的含量 mg/g

續(xù)表1

編號購買地時間產(chǎn)地JGDBBXXDYDY合計S21山東臨沂2011.08不詳-2.871.353.948.16S22山東煙臺2011.08不詳-2.504.042.408.94S23湖北通山2011.08不詳-2.082.192.606.87S24河南新鄉(xiāng)2011.08不詳1.477.19--8.66S25安徽霍山2011.08不詳-6.82--6.82S26山東招遠2011.08不詳-6.671.272.5410.48S27湖北荊州2011.08不詳1.23-3.283.568.07S28河南醴陵2011.08不詳-2.57-9.5412.11S29山西大同2011.08不詳--3.962.406.36S30廣東廣州2011.08不詳1.81--2.844.65S31福建廈門2011.08不詳-3.36-4.057.41S32海南?？?2011.08不詳4.741.97--6.71S33廣西南寧2011.08不詳--1.644.045.68S34河北安國2014.09四川1.294.00-3.468.75S35河北安國2014.09湖南/湖北--8.00-8.00S36河北安國2014.09廣西-2.613.902.128.63S37河北安國2014.09廣西1.2212.48--13.70S38河北安國2014.09廣西---13.8313.83S39河北安國2014.09廣西1.21-2.305.288.79S40河北安國2014.09廣西---2.292.29S41河北安國2014.09廣西-4.58--4.58S42河北安國2014.09湖南---6.206.20S43河北安國2014.09越南--3.592.866.45S44河北安國2014.09重慶1.199.35--10.54S45安徽亳州2014.09不詳1.402.43-8.8312.66S46安徽亳州2014.09云南1.323.28-5.8710.47S47安徽亳州2014.09湖北-7.41--7.41S48安徽亳州2014.09湖北---8.608.60S49安徽亳州2014.09湖北1.29--4.916.20S50安徽亳州2014.09江西---9.099.09S51安徽亳州2014.09湖北1.243.88-4.789.90S52安徽亳州2014.09湖北---6.376.37S53廣西玉林2016.07云南3.23--2.765.99S54廣西玉林2016.08云南---3.773.77S55廣西玉林2016.08廣西桂林1.205.073.58-9.85S56廣西玉林2016.08廣西百色-2.68-7.179.85S57廣西玉林2016.08廣西百色-1.48--1.48S58廣西玉林2016.08廣西百色-3.13--3.13S59廣西玉林2016.08廣西靖西2.245.47--7.71S60廣西玉林2016.08海南--8.87-8.87S61廣西玉林2016.08廣西防城港1.98--2.924.90S62廣西玉林2016.08廣西桂林9.13---9.13

續(xù)表1

編號購買地時間產(chǎn)地JGDBBXXDYDY合計S63廣西玉林2016.08廣西玉林-11.58--11.58S64廣西玉林2016.08廣西容縣--4.41-4.41S65廣西玉林2016.08貴州--2.59-2.59S66廣西玉林2016.08貴州--8.61-8.61S67廣西玉林2016.08廣西平南---4.154.15S68廣西玉林2016.08廣西柳州-1.41--1.41S69廣西玉林2016.11廣西玉林---11.9811.98S70廣州清平2017.03云南1.402.80-4.338.53S71廣州清平2017.03安徽1.457.96--9.41S72廣州清平2017.03四川-2.35-2.604.95S73廣州清平2017.03湖北1.954.37--6.32S74廣州清平2017.03廣西---6.986.98S75湖北宜昌2017.06湖北宜昌-7.48--7.48S76湖北宜昌2017.06湖北宜昌1.957.42--9.37S77四川達州2017.06四川達州-3.08--3.08S78四川達州2017.06四川達州-9.07--9.07S79云南普洱2017.06云南普洱---8.588.58S80湖北宜昌2017.06湖北宜昌-4.77--4.77S81越南2017.06越南--4.30-4.30S82緬甸2017.06緬甸-4.83--4.83S83越南2017.06越南---6.166.16平均1.984.753.735.347.47

注：“-”為低于檢測限；JGD:金剛大堿，BBX:百部新堿，XDY:新對葉百部堿，DY:對葉百部堿。下表同

3.2 對葉百部藥材中4種生物堿的分布方式

從83批藥材中4種生物堿的分布(圖2)來看，含有百部新堿(48；表示藥材批次，下同)和對葉百部堿(48)的藥材批次較多，含金剛大堿(27)和含新對葉百部堿(22)的藥材批次較少。從藥材中含有的生物堿數(shù)目來看，38批藥材含有單一生物堿，約占總批次的45.8%；28批藥材含有兩種生物堿，約占總批次的33.7%；17批藥材含有三種生物堿，約占總批次的20.5%；沒有發(fā)現(xiàn)同時含有4種生物堿的藥材。這個結(jié)果或多或少地說明百部生物堿的分布具有趨單性，含有1～4種生物堿的藥材比例呈現(xiàn)依次遞減的趨勢(45.8%→33.7%→20.5%→0%)，含2種以上生物堿的藥材僅占54.2%。

3.3 對葉百部藥材中2種以上生物堿同時出現(xiàn)的概率分析

對含有特定生物堿藥材中其他成分出現(xiàn)的概率進行了分析(表2)。含有金剛大堿的27批藥材中，單含金剛大堿的可能性僅3.7%，大多數(shù)情況下會同時含有百部新堿(59.3%)或?qū)θ~百部堿(59.3%)；含有百部新堿的48批藥材中，同時含有對葉百部堿的概率最高(41.7%)，其次是單含百部新堿(35.4%)或同時含有金剛大堿(33.3%)的藥材；含有新對葉百部堿的22批藥材中，同時含有對葉百部堿的概率最高(63.6%)；而含有對葉百部堿的48批藥材中，同時含有百部新堿的概率最高(41.7%)。該結(jié)果可用于對照品短缺情況下對葉百部藥材化學成分的預測。

J、B、X、D分別為金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿

圖2對葉百部藥材中4種生物堿的分布方式

表2 對葉百部藥材中4種生物堿出現(xiàn)的概率

注：a表示僅含有JGD；b表示含有JGD+BBX、JGD+BBX+(XDY或DY)

3.4 對葉百部藥材中4種生物堿的分布與購買地關(guān)系淺析

雖然以上4種成分都具有鎮(zhèn)咳作用，但Xu等[8]研究表明，金剛大堿可以透過血腦屏障而影響中樞神經(jīng)，因此金剛大堿可能具有一定的毒性或殺蟲活性，可能與百部的“有小毒”相關(guān)。根據(jù)使用目的，有時需要定向選擇或者避開含有某些特定主成分的藥材。從主要購買地來看，購于河北安國市場的藥材，對葉百部堿所占比例較高，其余三種生物堿所占比例接近；購于安徽亳州市場的藥材，對葉百部堿所占比例較高，但不含新對葉百部堿；購于廣西玉林市場的藥材，4種生物堿所占比例接近；購于廣州清平市場的藥材，除不含新對葉百部堿外，其余三種生物堿所占比例較為接近?？紤]到各藥材市場貨源的相對穩(wěn)定性，該結(jié)果對于購買特定生物堿的百部藥材具有一定的指導意義。

總之，本文測定了不同時間收集的83批來自全國各地的對葉百部商品藥材，經(jīng)鑒定全為對葉百部；含量測定結(jié)果表明，雖然對葉百部的化學成分復雜多變，難以建立統(tǒng)一的質(zhì)量標準，但每批百部藥材至少含有金剛大堿、百部新堿、新對葉百部堿和對葉百部堿四者之一。