陳 斌，周 謙，錢 驊，黃曉德，朱羽堯，賈源濱，趙伯濤*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211111；2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 江蘇 南京 210028；3.南京曜動(dòng)節(jié)能環(huán)?？萍加邢薰?，江蘇 南京 210042)

本文參考GB5413.5—2010采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)來測定枯草芽孢桿菌(Bucillussubtilis)發(fā)酵液中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，以期為枯草芽孢桿菌(Bucillussubtilis)生物轉(zhuǎn)化蔗糖為葡聚糖過程中底物濃度的變化，提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的分析方法。

1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜儀，ELSD-2000ES蒸發(fā)光散射檢測器( Alltech) 。蔗糖對(duì)照品(國藥化學(xué)試劑廠)，D-無水葡萄糖對(duì)照品(國藥化學(xué)試劑廠)，D-果糖對(duì)照品(國藥化學(xué)試劑廠)，乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液(中國藥科大學(xué)制備)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

氨基糖柱(4.6 mm × 250 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水 (80∶20) ； 流量1.0 mL/min ；柱溫30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度85 ℃；載氣為空氣，載氣流量2.2 L/min，分流閥關(guān)閉。

2.2 對(duì)照品及供試液的制備

(1) 對(duì)照品溶液取蔗糖對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入50% 乙腈水溶液適量，超聲溶解，放冷，加50%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液貯備液。取對(duì)照品溶液貯備液適量，加50%乙腈水溶液制成0.25 mg/mL的溶液，即得。

(2) 供試品溶液取供試品約25 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加入50% 乙腈水溶液適量，搖勻，作為對(duì)照品溶液貯備液。取對(duì)照品溶液貯備液適量，加50% 乙腈水溶液制成0.25 mg/mL 的溶液，即得。

(3) 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液取蔗糖對(duì)照品、葡萄糖對(duì)照品、果糖對(duì)照品適量，精密稱定，加“2.1”項(xiàng)下流動(dòng)相溶解并制成含蔗糖0.25 mg/mL，葡萄糖0.25 mg/mL，果糖0.25 mg/mL的混合溶液，如圖1中A和B分別為標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照片對(duì)應(yīng)的HPLC圖譜。

圖1 葡萄糖、果糖、蔗糖的HPLC圖譜(其中A、B分別為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜和供試液圖譜)

2.3 線性范圍及精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液貯備液適量，加50%乙腈水溶液制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各取10 μL依法測定，以峰面積的自然對(duì)數(shù)對(duì)溶液濃度的自然對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，分別得到果糖的回歸方程y=0.8458x+44.542,R2=0.993 2,葡萄糖的回歸方程y=0.334x+148.32,R2=0.991 3、蔗糖的回歸方程y=0.450 8x+102.77,R2=0.991 1，在0.2 ～ 1.0 mg/mL范圍內(nèi)蔗糖濃度的自然對(duì)數(shù)與峰面積的自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。取線性范圍中間濃度連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD為1.34%，說明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品5份，分別按“2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定峰面積，其RSD為1.57%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在放置0，2，4，8，12，24 h 依上述方法測定，測定峰面積，計(jì)算其RSD為0.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批發(fā)酵制備完成的供試品9 份，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品(果糖、蔗糖、葡萄糖)適量，加50% 乙腈水溶液適量，超聲溶解，放冷，加50% 乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，依上述法測定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率果糖、葡萄糖和蔗糖的加樣回收率分別為99.56%、99.16%、99.75%，RSD分別為1.56%、1.37%和1.79。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測定

取3批枯草芽孢桿菌發(fā)酵液樣品，按上述方法平行檢測5次，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果發(fā)酵液中果糖、葡萄糖、蔗糖分別為0.36 mg/mL、0.60 mg/mL、31.36 mg/mL通過計(jì)算，發(fā)酵液中蔗糖的轉(zhuǎn)化率約為67.68%。

3 討 論

糖類含量測定方法有多種，其中比色法[1]、分光光度法[2]、滴定法[3]等方法選擇性差，測定過程繁雜；氣相色譜法[4]雖可分別測定不同糖的含量，靈敏度高，但由于糖類化合物沸點(diǎn)高，難以汽化，必須進(jìn)行衍生化才能檢測，檢測步驟繁瑣，應(yīng)用較少；紫外—高效液相色譜法應(yīng)用廣泛，但糖類無紫外吸收，無法直接采用高效液相色譜紫外檢測器對(duì)糖類化合物進(jìn)行分析；國標(biāo)GB/T 18932.22—2003[5]，GB/T 22221—2008[6]，GB/T 5009.8—2008[7]等均采用用高效液相示差折光檢測法測定糖類物質(zhì)，但由于示差折光檢測器[8](RID)對(duì)溫度、流動(dòng)相的組成等的變化敏感，靈敏度較低，結(jié)果常常不理想；蒸發(fā)光檢測器[9]( ELSD) 是基于不揮發(fā)的樣品顆粒對(duì)光的散射程度與其質(zhì)量呈正比而進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、不受溫度和流動(dòng)相組成的影響、可用于梯度洗脫等優(yōu)點(diǎn)，特別適合糖類化合物的分析?！吨袊幍洹?010 年版二部[10]藥用輔料蔗糖標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下無含量測定，在目前常用的高效液相色譜測定蔗糖的方法中，示差折光檢測器靈敏度低、重現(xiàn)性差，而ELSD 檢測器靈敏度具有靈敏度高、不受溫度和流動(dòng)相組成的影響、本文參考GB 5413.5—2010采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)來測定枯草芽孢桿菌(Bucillussubtilis)發(fā)酵液中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，該分析方法準(zhǔn)確、靈敏、快速，可以應(yīng)用于枯草芽孢桿菌(Bucillussubtilis)生物轉(zhuǎn)化蔗糖為葡聚糖過程中底物濃度的檢測。