盧 棉，李舒婷，藍苑丹，莫恭曉，梁尋杰，黃景珠，黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1.臨床學(xué)院；2.藥學(xué)院；3.廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色 533000)

玉蘭(MagnoliadenudateDesr.)屬玉蘭亞屬的代表種，為中國早春觀賞植物，北京及長江以南等區(qū)域均有培育[1-2]。玉蘭花蕾可入藥，歸肺胃經(jīng)，性溫昧辛，具有散風(fēng)寒、通竅等諸多藥效，多用于治療風(fēng)寒、頭痛等癥狀[3]。白玉蘭是木蘭科玉蘭屬植物，其主要化學(xué)成分為黃酮，而黃酮是從天然植物中提取分離的一類次生代謝產(chǎn)物，黃酮于植物中可有多種存在方式，屬于一種很強的抗氧化劑，可有效清除運動中機體所產(chǎn)生的氧自由基[4]，如花青素，可以抑制油脂性過氧化物的溢出，阻礙細胞的衰老退化，這種阻止氧化的能力是VE的十倍以上，故可調(diào)節(jié)人體的抗氧化能力，可阻礙癌癥的產(chǎn)生，同時也預(yù)防人體衰老。黃酮類物質(zhì)除了具有抗氧化作用外，還有降血脂、抗菌、預(yù)防心腦血管疾病等生理活性功能，同時可針對各類肝損傷有不同程度的保護效應(yīng)[4],可廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-6]。熱回流提取法是提取植物中總黃酮的傳統(tǒng)方法。近年來，隨著提取技術(shù)的不斷發(fā)展，不少學(xué)者使用超聲波輔助法分別從黃花菜、馬齒莧等植物中提取總黃酮[7]。通過控制一定的超聲頻率和強度,利用超聲波的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機械效應(yīng)[8],造成植物細胞壁及整個生物體瞬間破裂,加快細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解,進一步提高植物成分的提取效果。但超聲波技術(shù)應(yīng)用于提取玉蘭花總黃酮的研究尚未見報道。本實驗將采用超聲波提取方法[9],對超聲波提取的影響因素進行研究,通過正交實驗確定最佳提取條件,為更好地利用玉蘭花積累科研基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器

N4S紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-15臺式連續(xù)投料粉碎機 (溫嶺市林大機械有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1204B電子天平 (上海天美天平儀器有限公司)；TDL80-2B臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器)。

1.1.2 試劑與藥材

白玉蘭花(Magnolia flowers)采于廣西南寧市橫縣。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，供UV法測定含量為92.5%)；95%乙醇、蒸餾水、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉均為國內(nèi)分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 材料處理

取自然晾曬后的白玉蘭花放入干燥箱內(nèi)，置于43 ℃下干燥30 min，粉碎過70目篩備用，密封干燥保存。

1.2.2 玉蘭花總黃酮測定方法的建立

(1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.000 mg置于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇2.0 mL使之溶解，再加入95%乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每1 mL含無水蘆丁0.20 mg。

(2) 測定方法

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，以不加樣品為空白對照，分別加入95%乙醇至5.0 mL，振蕩搖勻；其次分別加5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min；加10%氯化鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液2.0 mL，再加入95%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。

(3) 最大吸收波長的確定

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶，其他操作方法如1.2.2.2所示，以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白對照管，在340～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，于370 nm處得出最大吸收峰波長。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取蘆丁對照品溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，按上述方法操作后，在最大吸收峰波長處測吸光度值,所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得線性回歸方程為A=0.0223C-0.0137(R2=0.992 0),其中：A為吸光度，C為蘆丁濃度/(μg/mL)。

(5) 玉蘭花總黃酮得率的計算

精密稱取1.000 g玉蘭花粉末，按實驗設(shè)計條件進行超聲提取，采用AlCl3-NaNO2-NaOH顯色法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由吸光度A計算黃酮質(zhì)量濃度C，則玉蘭花總黃酮得率Y計算公式為：Y=(C·N·V·10-6/m)×100%。(C：黃酮質(zhì)量濃度,μg/mL；N:稀釋倍數(shù)；V：濾液體積,mL；m：樣品質(zhì)量,g)

(6) 單因素實驗

按照2.2.2測定方法，分別精確稱取1.000 g玉蘭花粉末，置于相同容積的容量瓶中，用一定體積分?jǐn)?shù)、容積的乙醇作溶劑，在不同超聲功率、溫度、時間的超聲波條件下提取，抽濾離心，測定離心液在最大吸收峰波長下的吸光度值。

(7) 正交實驗

根據(jù)單因素實驗，為了進一步確定超聲提取玉蘭花總黃酮的最佳工藝條件，以超聲功率、超聲溫度、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比為參考因素，選用L16(45)正交表進行5因素4水平正交試驗。

1.2.3 單因素實驗

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

在液固比為30 mL/g，提取時間為20 min，提取溫度為40 ℃和超聲功率為80 W下，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于80%時，總黃酮的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，總黃酮得率最大(如圖1所示)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

(2) 液固比對總黃酮得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取時間為20 min，提取溫度為40 ℃和超聲功率為80 W下，當(dāng)液固比為30 mL/g時，黃酮得率最大(如圖2所示)。

圖2 液固比對總黃酮得率的影響

(3) 超聲溫度對總黃酮得率的影響，

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液固比為30 mL/g，提取時間為20 min和超聲功率為80 W下，當(dāng)提取溫度為40 ℃時，黃酮得率最大(如圖3所示)。

(4) 超聲時間對總黃酮得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液固比為30 mL/g，提取溫度為40℃和超聲功率為80 W下，當(dāng)提取時間為10～20 min時，黃酮得率呈上升趨勢，隨后隨時間的延長而逐漸下降。當(dāng)提取時間為20 min時，總黃酮得率最大(如圖4所示)。

圖3 超聲溫度對總黃酮得率的影響

圖4 超聲時間對總黃酮得率的影響

(5) 超聲功率對總黃酮得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液固比為30 mL/g，提取溫度為40℃和提取時間為20 min下，當(dāng)超聲功率小于140 W時，黃酮得率隨超聲功率的增長而增大，當(dāng)超聲功率為140 W時，總黃酮得率最大，然后隨著功率的增加而下降，超過180 W時，總黃酮得率有上升趨勢(如圖5所示)。

圖5 超聲功率對總黃酮得率的影響

(6) 正交設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上選用L16(45)正交試驗，對玉蘭花提取工藝過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液固比(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)、超聲功率(E)等因素進行全面考察。優(yōu)選影響提取工藝的最佳因素。正交設(shè)計因素水平見表1。

表1 玉蘭花中總黃酮超聲提取工藝正交因素和水平

表2 玉蘭花中總黃酮超聲波提取工藝正交試驗及結(jié)果

表2結(jié)果表明，各因素影響程度為：B(液固比)>E(超聲功率)>D(超聲時間)>C(超聲溫度)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))。在16種試驗中，玉蘭花粉末均為1.000 g，且表中顯示試驗號5(即A2B1C2D3E4)的得率最大，為0.84%，即超聲提取玉蘭花總黃酮的最佳工藝提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比為10 mL/g、超聲溫度35 ℃、超聲時間30 min、超聲功率180 W。

2 結(jié) 論

最優(yōu)條件下提取玉蘭花總黃酮得率為0.84%，比葉青等[3]采用微波輔助萃取玉蘭花總黃酮的產(chǎn)率(0.45%)高，也比吳子龍等[1]采用水浴法提取玉蘭花總黃酮的產(chǎn)率(7.63 mg/g,即0.763%)高。超聲提取玉蘭花總黃酮，速度快，收率高，設(shè)備簡單，提取效果明顯優(yōu)于微波輔助提取及水浴提取法。且黃酮類化合物有明顯的抗?jié)?、解痙、抗炎及降血脂等系列的生物活性[10],由此可見,玉蘭花有很好的開發(fā)利用價值,進行玉蘭花總黃酮提取工藝的研究很有必要。