廣澤宇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264003）

植物病害一直在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有較大影響，化學(xué)防治是控制植物病害的有效方法，其具有見效快、殺菌譜廣、成本低、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［1］，但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥致使病原菌產(chǎn)生了耐受性，并且農(nóng)藥對(duì)人、畜和環(huán)境都有一定的危害。隨著近年來(lái)人們對(duì)食品安全及環(huán)境污染問(wèn)題關(guān)注度的提高，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已被嚴(yán)格限制使用［2］。生物防治技術(shù)是一種無(wú)殘留無(wú)污染、不殺傷天敵、不會(huì)產(chǎn)生抗藥性［3］、有利于人畜安全及環(huán)境保護(hù)的無(wú)公害環(huán)保技術(shù)，有利于提高經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)效益，有廣闊的發(fā)展前景［4］。因此，生物防治尤其是微生物防治在將來(lái)可能替代化學(xué)藥劑成為一個(gè)環(huán)保安全的選擇［5］。

本研究旨在從植物根際土壤中分離篩選對(duì)植物病原微生物具有生防作用的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定。分離篩選出高效生防的芽孢桿菌，為以后拮抗型生物肥料以及生物農(nóng)藥的生產(chǎn)提供高效的菌種，同時(shí)為菌種的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物病原菌株。立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、葫蘆科刺盤孢Colletotrichumlagenarium、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、玉蜀黍離蠕孢（Bipolarismaydis）、鏈格孢（AlternariaNees）、尖孢鐮刀（Fusariumoxysporum）、腐皮殼霉（Fusariumsolani）、交鏈孢霉（Alternaria sp.），試驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑NA。固體培養(yǎng)基、NB液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、FastDNA?SPINKitfor SoilDNA試劑盒，Trans2KPlusⅡ DNAMarker、6×DNA LoadingBuffer、Agarose、50×TBE。

1.1.3 儀器設(shè)備。生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司）、核酸蛋白檢測(cè)儀（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）以及梯度PCR儀（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤中芽孢桿菌的分離與純化。從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院校內(nèi)菜地采集土樣，陰干研磨后稱取10g，放入100mL無(wú)菌水于250mL三角瓶中，搖動(dòng)3～5min，在80℃水浴中加熱10min［6］。梯度稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)48h。挑取單菌落、鏡檢，根據(jù)單菌落大小、表面結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、光澤和顏色等特征，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落，采用劃線分離的方法純化，將已純化的菌株保存于NA培養(yǎng)基斜面?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 拮抗菌株的篩選。對(duì)分離純化到的芽孢桿菌，以供試病原真菌為靶標(biāo)，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法［8］，用皿內(nèi)瓊膠平板直接測(cè)定。逐日觀察菌落的生長(zhǎng)和細(xì)菌的抑制作用，選擇拮抗性好的菌株進(jìn)入復(fù)篩。以初篩結(jié)論為基礎(chǔ)，在PDA平板中心先接種病原菌，一兩天后在四周接種同一種芽孢桿菌菌株，兩者相距5cm，3次重復(fù)，分別以細(xì)菌和病原菌在PDA上的純培養(yǎng)為對(duì)照，28℃培養(yǎng)，逐日觀察菌落的生長(zhǎng)和細(xì)菌的抑制作用，篩選生長(zhǎng)速度快、抑制率高的菌株。

1.2.3 生防芽孢桿菌優(yōu)良菌株的初步鑒定

1.2.3.1 培養(yǎng)特征的觀察。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［9］中的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，將菌株分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，倒置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察生防菌株在培養(yǎng)基上的菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.3.2 菌體形態(tài)的觀察。挑取在斜面培養(yǎng)48h的生防芽孢桿菌菌落于載玻片上，分別進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、及莢膜染色，并在顯微鏡下觀察拮抗菌的大小和形態(tài)。

1.2.3.3 16SrRNA基因的擴(kuò)增與測(cè)序。將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃溫度，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)，12000r/min離心收集菌體，用FastDNATMSPINKitfor Soil試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。使用細(xì)菌16SrDNA通過(guò)引物27F和1492R對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增［10］。PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.3.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。根據(jù)16sSrRNA測(cè)序結(jié)果，登陸NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列相似性比對(duì)搜索，從中獲得相似性較高的典型菌株序列作為參比對(duì)象，用MEGA8.0生物軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌的分離篩選

本試驗(yàn)共分離純化芽孢桿菌33株，經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出對(duì)病原菌具有拮抗作用的菌株6株，其中菌株B-Q4對(duì)立枯絲核菌、玉蜀黍離蠕孢、腐皮殼霉、交鏈孢霉均具有良好的拮抗作用，確定為最優(yōu)菌株（如圖1所示）。

2.1.1 培養(yǎng)特征觀察結(jié)果。B-Q4在NA培養(yǎng)基平板上菌落為圓形或近圓形，直徑5mm，乳白色，質(zhì)地軟、無(wú)色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質(zhì)，邊緣不整齊（如圖2所示）。

圖2 菌株在平板上的菌落特征

2.1.2 菌體形態(tài)觀察結(jié)果。B-Q4菌體呈短桿狀，在電子顯微鏡下大小為（1.0～1.2）μm×（3.0～4.0）μm，培養(yǎng)48h后產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無(wú)明顯膨大。革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)莢膜（如圖3所示）。

圖3 B-Q4菌體形態(tài)（電子顯微鏡下）

2.2 基因組DNA的提取及16SrDNAPCR擴(kuò)增

利用FastDNATMSPINKitforSoil試劑盒提取的細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（如圖4所示），獲得了約1500bp的條帶。

圖4 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

注：M為Trans2KPlusⅡDNAMarker分子量標(biāo)準(zhǔn)1為B-Q416SrDNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3 16SrDNA序列分析比對(duì)結(jié)果

以B-Q4基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的特異16SrDNA片段長(zhǎng)度為1434bp（如圖5所示），將B-Q4菌株的16SrDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，B-Q4菌株與BacilluscereusSP31的序列相似性達(dá)到99%，通過(guò)MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示菌株B-Q4都與Bacilluscereus親緣關(guān)系最近。

圖5 特異16SrDNA片段長(zhǎng)度

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)B-Q4菌株進(jìn)行了分子鑒定及其生物學(xué)特性的研究。通過(guò)16SrDNA序列分析，對(duì)B-Q4進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，B-Q4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。B-Q4在NA培養(yǎng)基平板上菌落為圓形或近圓形，乳白色，質(zhì)地軟、無(wú)色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質(zhì)，邊緣不整齊；在斜面上劃線培養(yǎng)呈直線生長(zhǎng)；在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，液體混濁具有菌膜。其形態(tài)學(xué)研究進(jìn)一步說(shuō)明B-Q4是蠟樣芽孢桿菌。

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