李春玲 牛良飛 李海聰 吳康 盧水華 范小勇

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)是結(jié)核病中最常見的類型，也是威脅人類健康的主要傳染性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約15% 的結(jié)核病患者并發(fā)有糖尿病(diabetes mellitus, DM)，且這個(gè)比率在未來的幾十年里可能會(huì)繼續(xù)增加[1]。結(jié)核感染病灶及血液循環(huán)系統(tǒng)中均存在著一定的氧化環(huán)境[2]，在正常情況下機(jī)體內(nèi)氧化物的生成與抗氧化物的清除能力處于動(dòng)態(tài)平衡之中，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧化物質(zhì)超出其抗氧化能力，則引起氧化與抗氧化失衡狀態(tài)(稱之為氧化應(yīng)激)[3]。并發(fā)糖尿病可加重結(jié)核病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，包括其治愈率降低、死亡率升高、耐藥突變?cè)黾拥萚4]，但是否與氧化物的過量生成有關(guān)，相關(guān)研究還不多。本研究通過定量檢測(cè)PTB患者、肺結(jié)核并發(fā)2型糖尿病(PTB-DM2)患者，及健康對(duì)照志愿者血漿中氧化物的水平，探討PTB-DM2患者血漿氧化應(yīng)激水平的變化。

材料和方法

1. 研究對(duì)象：納入2016年2月至2017年1月上海市公共衛(wèi)生臨床中心收治的45例初治肺結(jié)核患者(PTB組)與28例肺結(jié)核并發(fā)2型糖尿病患者(PTB-DM2組)，2組患者按照年齡及治療時(shí)間匹配入組；另納入24名在我中心體檢的無結(jié)核病和糖尿病癥狀及相關(guān)病史、無結(jié)核病密切接觸史的健康志愿者作為對(duì)照組(HC組)。所有入組者除外并發(fā)腫瘤、HIV 感染或AIDS、病毒性肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病、內(nèi)分泌功能失調(diào)及其他細(xì)菌感染者。本研究通過了上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會(huì)審核，入組者均知情同意并簽署知情同意書。入組者基本信息見表1。PTB組及PTB-DM2組患者的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)見表2。

2.疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)：PTB的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)2017發(fā)布的《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[5]，糖尿病的診療參照2017版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》[6]。

表1 基本信息在三組患者中的分布情況

注a：年齡以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]進(jìn)行描述；統(tǒng)計(jì)值是三組數(shù)值的比較，方法是行×列卡方檢驗(yàn)；b：存在理論頻數(shù)小于1數(shù)據(jù)，采用Fisher確切概率法

表2 實(shí)驗(yàn)室異常指標(biāo)在PTB組與PTB-DM2組的分布

注 表中括號(hào)外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“發(fā)生率(%)”；“-”：理論頻數(shù)小于1，采用Fisher確切概率法

3.檢測(cè)指標(biāo)及方法：用肝素抗凝管采集所有受試者的晨起空腹靜脈血，800×g離心10 min分離血漿后置于-80 ℃?zhèn)溆??？偪寡趸芰?total anti-oxidant capacity，T-AOC)檢測(cè)采用鐵離子被還原成亞鐵離子后與菲啉類物質(zhì)絡(luò)合的顯色比色法，結(jié)果以U/ml表示；過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測(cè)采用乙酸-重鉻酸鉀與過氧化氫反應(yīng)的顯色比色法，結(jié)果用U/ml表示；血紅素氧合酶-1(heme oxygena-se 1, HO-1)檢測(cè)采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，結(jié)果以ng/ml表示；還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)檢測(cè)采用酶標(biāo)法，利用5,5′-二硫基-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)循環(huán)反應(yīng)檢測(cè)血漿中GSH的含量，結(jié)果以μmol/ml表示；超氧化物歧化酶(superoxide dismutae, SOD)檢測(cè)采用水溶性四唑鹽試劑(WST-1)法，結(jié)果以U/ml表示；丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測(cè)采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物比色法，結(jié)果以nmol/ml表示。所有檢測(cè)試劑均采購(gòu)自南京建成生物工程技術(shù)有限公司，檢測(cè)方法均嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，文中數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-SmirnovZ檢驗(yàn)不符合正態(tài)分布，故計(jì)量資料使用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]”表示，假設(shè)檢驗(yàn)方法采用非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))，兩個(gè)獨(dú)立樣本采用非參數(shù)檢驗(yàn)(即Kruskal-WallisZ檢驗(yàn))，三組數(shù)值的比較，采用行×列卡方檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)；理論頻數(shù)小于1時(shí)采用Fisher確切概率法。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文中點(diǎn)圖采用GraphPad Prism 7.0 軟件制作。

結(jié) 果

結(jié)果顯示，3組人群血漿中的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD等抗氧化物的含量及MDA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，詳見表3。PTB組患者血漿的T-AOC、CAT、HO-1含量較HC組均明顯下降，MDA水平較HC組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.88，P<0.01;Z=-3.82，P<0.01；Z=-3.21，P=0.005；Z=-3.94，P=0.008)；GSH、SOD水平PTB組與HC組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.27，P=0.203；Z=-0.83，P=0.406)。PTB-DM2組患者的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD水平較PTB組患者均明顯下降，MDA水平較PTB組患者明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.08，P=0.047；Z=-2.44，P=0.046；Z=-2.27，P=0.023；Z=-2.45，P=0.096；Z=-3.50，P=0.002；Z=-6.01，P<0.01)。3組各指標(biāo)差異點(diǎn)狀展示見圖1～6。

討 論

近年來，隨著慢性炎癥性疾病的高發(fā)，氧化應(yīng)激與慢性炎癥性疾病的研究得以廣泛開展[7-8]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧化物可很快被抗氧化系統(tǒng)清除，氧化物的生成與抗氧化物的清除能力處于動(dòng)態(tài)平衡之中。結(jié)核分枝桿菌是一種專性需氧的胞內(nèi)寄生菌，主要在宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)增殖。當(dāng)吞噬細(xì)胞吞噬入侵的結(jié)核分枝桿菌之后，機(jī)體在殺死病原菌的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，其中羥自由基等氧化能力較強(qiáng)，易造成細(xì)胞及組織損傷。機(jī)體一方面需要消耗更多的抗氧化物質(zhì)來維持自身氧化平衡，另一方面這些過量的自由基可通過與巰基(-SH)結(jié)合使含巰基的抗氧化劑失活，加之PTB患者自身營(yíng)養(yǎng)狀況不良，大多缺乏維生素C、維生素E等抗氧化物質(zhì)[9-10]，極易導(dǎo)致PTB患者體內(nèi)氧化物過多，抗氧化物質(zhì)減少，氧化和抗氧化平衡狀態(tài)被打破。PTB-DM2患者的長(zhǎng)期高血糖可加重機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而反作用于患病機(jī)體使病情加重。目前，常用的檢測(cè)血液氧化應(yīng)激水平的保護(hù)性指標(biāo)有T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD，氧化脂質(zhì)損傷的指標(biāo)為MDA。T-AOC是機(jī)體對(duì)抗氧化能力的總體反應(yīng)；CAT具有清除體內(nèi)H2O2的功能，在抗氧化過程中具有重要作用[11]；HO-1是一種誘導(dǎo)型胞內(nèi)酶，廣泛存在于多種細(xì)胞及組織中，是一種氧化應(yīng)激的拮抗劑[12]；GSH是一種水溶性的抗氧化物，其活性巰基結(jié)構(gòu)是重要的功能基團(tuán)；SOD是能通過歧化反應(yīng)將超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣的一種酶，是機(jī)體強(qiáng)有力的抗氧化劑和自由基清除劑，在保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA損傷過程中起著重要的作用；MDA是脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊脂質(zhì)過氧化的程度。

表3 氧化應(yīng)激狀態(tài)指標(biāo)在不同組中的檢測(cè)結(jié)果比較

注 表中計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，使用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]”表示，三組數(shù)值比較采用行×列卡方檢驗(yàn)

圖1～6 不同人群血漿中T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD與MDA的檢測(cè)結(jié)果。其中HC為健康志愿者，PTB為肺結(jié)核患者，PTB-DM2 為肺結(jié)核并發(fā)2型糖尿病患者。圖1～3 分別可見PTB組的T-AOC、CAT、HO-1水平均低于HC組，高于PTB-DM2組。圖4、5 可見PTB組的GSH、SOD水平均低于HC組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但高于PTB-DM2組。圖6 可見PTB組的MDA水平高于HC組，低于PTB-DM2組

本研究發(fā)現(xiàn)，PTB患者血漿中T-AOC、CAT及HO-1水平均明顯低于HC組，提示機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，處于氧化與抗氧化失衡狀態(tài)且存在脂質(zhì)氧化損傷加重。有研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，PTB組血清氧化物及脂質(zhì)損傷標(biāo)志物MDA含量均較高，致總抗氧化能力顯著降低[13]。與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與單純PTB患者相比，PTB-DM2患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)更加惡化，T-AOC和其他抗氧化物水平均明顯降低。提示PTB并發(fā)糖尿病后，可加劇患者機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化失衡，機(jī)體的氧化損傷更為嚴(yán)重，可能與糖尿病患者胰島素功能不全及高血糖誘發(fā)相關(guān)。有研究認(rèn)為，糖尿病引發(fā)的高血糖是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧(ROS)及活性氮(RNS)的主要原因，過多糖代謝產(chǎn)物也是加重氧化物與抗氧化系統(tǒng)失衡的重要因素。研究表明，胰島素具有抗氧化的作用，其可以通過胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)各種抗氧化酶及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，其中包括核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2(Nrf2)和核因子κB(NF-κB)，致ROS產(chǎn)生減少并促進(jìn)ROS消除[14]。而2型糖尿病患者多為胰島素抵抗伴胰島素相對(duì)缺乏，即糖尿病患者體內(nèi)的胰島素正常功能受損，調(diào)節(jié)血糖的能力降低，可能也導(dǎo)致抗氧化的作用受到損傷。另外，氧化應(yīng)激不僅可以破壞胰島β細(xì)胞，抑制胰島素的合成與分泌，還可誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，誘發(fā)或加重糖尿病病情[1]。因此，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)核病患者更易并發(fā)糖尿病，而糖尿病本身與氧化應(yīng)激的相互拮抗將加重結(jié)核病患者體內(nèi)的氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)失衡，并使其治療效果及預(yù)后變差[15]。本研究結(jié)果表明，PTB-DM2患者的抗氧化能力降低，脂質(zhì)損傷加重。

綜上所述，本研究證明了PTB患者體內(nèi)存在抗氧化能力的降低及脂質(zhì)損傷，發(fā)現(xiàn)了并發(fā)2型糖尿病可以加重PTB患者的氧化應(yīng)激水平及脂質(zhì)氧化損傷。因此，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能為結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的輔助治療提供新思路。但是，由于氧化應(yīng)激指標(biāo)水平所受的影響因素較多[16]，需要進(jìn)一步優(yōu)化氧化應(yīng)激生化指標(biāo)的檢測(cè)，加強(qiáng)對(duì)PTB或PTB-DM2患者的輔助診斷及預(yù)后的監(jiān)測(cè)。