程麗平 張曉巖 沙巍

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一種條件致病菌，在自然界中廣泛存在[1]。近年來，隨著NTM細菌學和分子生物學鑒定技術的發(fā)展、人們對NTM認識水平的提高、人獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)的流行及人口老齡化等諸多因素的影響，NTM病患者呈快速增多的趨勢，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[2]。NTM肺病因無典型的臨床特異性癥狀和體征，且耐藥率高，致病菌種繁多，對臨床診斷及治療造成極大的困難。

筆者通過回顧性研究，選擇2014年1月至2017年10月同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科通過胸部CT檢查臨床疑診為NTM肺病的患者，取患者痰液標本分別進行PCR-反向斑點雜交法行分枝桿菌菌種鑒定基因檢測及分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法[對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長試驗]檢測，比較兩種檢測方法的差異，評價以胸部CT檢查為基礎，聯(lián)合應用PCR-反向斑點雜交法在NTM肺病診斷中的應用價值。

資料和方法

一、一般資料

1.患者來源及納入標準：納入2014年1月至2017年10月就診于同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科臨床疑診為NTM肺病的患者，納入患者均由2位結(jié)核科專科醫(yī)師參考文獻[2]和文獻[3]進行診斷。所選取患者具有呼吸系統(tǒng)癥狀，采用德國西門子128排螺旋CT儀(SOMATOM Perspective)進行胸部CT檢查，發(fā)現(xiàn)薄壁空洞影、多灶性支氣管擴張及多發(fā)性小結(jié)節(jié)病變等；同時排除NTM并發(fā)結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)混合感染、HIV感染、妊娠婦女、并發(fā)自身免疫系統(tǒng)疾病、有器官移植或免疫抑制劑用藥史及其他臟器疾病終末期的人群。共納入患者334例，其中男127例，女207例；年齡22～80歲，平均(59.29±13.13)歲。

2. 診斷標準：(1)NTM肺病診斷標準：痰NTM培養(yǎng)2次均為同一致病菌；支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvoelar lavage fluid，BALF)中NTM培養(yǎng)陽性1次，陽性度為++以上；BALF中NTM培養(yǎng)陽性1次，抗酸桿菌涂片陽性度為++以上；經(jīng)支氣管鏡或其他途徑進行肺活組織檢查，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學特征性改變(肉芽腫性炎或抗酸染色陽性)，并且NTM培養(yǎng)陽性；肺活組織檢查發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學特征性改變，并且痰標本和(或)BALF中NTM培養(yǎng)陽性≥1次[2]。(2)肺結(jié)核診斷標準：參考《肺結(jié)核診斷和治療指南》，痰液BACTEC MGIT 960法培養(yǎng)出MTBC；BALF標本BACTEC MGIT 960法培養(yǎng)出MTBC；支氣管或肺部組織病理學檢查證實為結(jié)核病變[4]。

3.臨床資料：334例患者中，并發(fā)支氣管擴張244例(73.05%)，肺內(nèi)存在空洞137例(41.02%)，出現(xiàn)多發(fā)性小結(jié)節(jié)影107例(32.04%)，并發(fā)慢性阻塞性肺疾病87例(26.05%)，并發(fā)間質(zhì)性肺病24例(7.19%)。

4.患者分組：(1)NTM肺病組。根據(jù)NTM肺病診斷依據(jù)，由2次痰液NTM培養(yǎng)陽性確診180例；1次BALF中NTM培養(yǎng)陽性確診42例；肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌的組織病理學特征性改變，且NTM培養(yǎng)陽性確診7例；其中11例為痰液和BALF均陽性。共218例，其中男79例，女139例；年齡25～80歲，平均(57.13±12.98)歲。(2)結(jié)核病組。納入的334例患者中，最終經(jīng)痰液或BALF培養(yǎng)及MTBC菌種鑒定確診肺結(jié)核40例，病理檢查確診肺結(jié)核2例；共42例，其中男19例，女23例；年齡22～72歲，平均(50.56±16.55)歲。(3)其他肺部疾病組。334例疑診為NTM肺病的患者，最終診斷確定74例為其他肺部疾病患者，分別為支氣管擴張并發(fā)感染56例，社區(qū)獲得性肺炎10例，真菌性肺病3例，肺癌3例，慢性肺膿腫1例，結(jié)節(jié)病1例；在本研究的分析中予以排除；上述患者診斷均依據(jù)相關診斷標準[5-6]。

二、研究方法

標本來源于患者晨起漱口后的痰液標本。根據(jù)我國《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[7]進行預處理，以PCR-反向斑點雜交法行分枝桿菌菌種鑒定、基因檢測，以及采用分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法(PNB、TCH培養(yǎng)基生長試驗)進行檢測。

1.PCR-反向斑點雜交法行分枝桿菌菌種鑒定、基因檢測：分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、PCR擴增儀、分子雜交儀均由亞能生物技術(深圳)有限公司提供。根據(jù)16S rRNA序列設計出23種特異的寡核苷酸探針，與生物素標記的PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，通過膜條特定位置顯色與否判斷探針是否與該DNA片段雜交，鑒定臨床上23種常見的致病性分枝桿菌。根據(jù)試劑盒的操作說明進行標本收集、樣本處理、核酸提取、試劑配置及PCR擴增、分析和結(jié)果判讀等。

2.分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法：分枝桿菌生長試驗采用“BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)”，試劑盒及儀器來源于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。對于培養(yǎng)陽性標本進一步接種至含有藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)所需標準濃度藥物的MGIT培養(yǎng)管[含OADC增菌液；成分為油酸(oleic acid)、白蛋白(albumin)、右旋糖(dextrose)和過氧化氫酶(catalase medium)，簡稱“OADC”]及空白對照MGIT培養(yǎng)管(不含OADC增菌液)，然后置入儀器內(nèi)進行培養(yǎng)，根據(jù)PNB及TCH的藥敏試驗結(jié)果可進行分枝桿菌菌種的初步鑒定，明確是MTBC或NTM。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以“例數(shù)”或“率”表示，采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、分枝桿菌檢測結(jié)果

根據(jù)胸部CT檢查結(jié)果，疑診NTM肺病的患者334例。其中，經(jīng)涂片抗酸桿菌檢測陽性206例(61.68%)，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測陽性226例；菌種鑒定為NTM 191例，菌種鑒定為MTBC 35例，分枝桿菌培養(yǎng)法檢出率為67.66%(226/334)。PCR-反向斑點雜交法檢測陽性216例，其中菌種鑒定為NTM 183例，菌種鑒定為MTBC 33例；分枝桿菌PCR-反向斑點雜交法檢出率為64.67%(216/334)。培養(yǎng)法及分枝桿菌PCR-反向斑點雜交法檢出率的比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.67，P=0.231)。

二、NTM肺病組采用2種檢測方法進行檢測的結(jié)果比較

218例NTM肺病組患者痰液PCR-反向斑點雜交法檢測NTM陽性183例，以最終確診情況為金標準，確認假陽性3例，敏感度為82.57%(180/218)，陽性預測值為98.36%(180/183)。PCR-反向斑點雜交法檢測NTM陽性的183例分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果見表1。傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定NTM陽性191例，以最終確診情況為金標準，假陽性0例，敏感度為87.61%(191/218)，陽性預測值為100.00%(191/191)。兩種方法檢出NTM的敏感度比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.20，P=0.169)。見表2、3。

表1 痰標本PCR-反向斑點雜交法檢測NTM陽性患者的

三、結(jié)核病組采用2種檢測方法進行檢測的結(jié)果比較

結(jié)核病組患者PCR-反向斑點雜交法檢測MTBC陽性33例，以最終確診情況為金標準，假陽性0例，檢測特異度為78.57%(33/42)，診斷結(jié)核病的陽性預測值為100.00%(33/33)。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測MTBC陽性35例，以最終確診情況為金標準，假陽性0例，檢測特異度為83.33%(35/42)，診斷結(jié)核病的陽性預測值為100.00%(35/35)。兩種檢測方法特異度比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.31，P=0.391)。見表2、3。

四、兩組患者采用2種檢測方法進行檢測的一致率比較

將2種檢測方法在兩組患者中的檢查結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)PCR-反向斑點雜交法進行檢測的總體診斷符合率為83.08%(216/260)[注：符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%]，傳統(tǒng)培養(yǎng)法的總體診斷符合率為86.92%(226/260)，兩種檢測方法比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.51，P=0.134)。進一步分析2種方法的檢測結(jié)果，結(jié)果如表4所示。

表2 不同檢測方法在兩組患者中的檢測結(jié)果比較

注a：χ2值和P值為2種檢測方法與確診患者實際診斷情況進行比較

表3 不同檢測方法的檢測結(jié)果比較(%)

注a：PCR-反向斑點雜交法檢測NTM陽性183例，以最終確診情況為金標準，確認假陽性3例；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；診斷NTM肺病陽性預測值=NTM真陽性例數(shù)/(NTM真陽性例數(shù)+NTM假陽性例數(shù)) ×100%；診斷結(jié)核病陽性預測值=結(jié)核病真陽性例數(shù)/(結(jié)核病真陽性例數(shù)+結(jié)核病假陽性例數(shù)) ×100%

表4 2種檢測方法在兩組患者中的陽性檢測結(jié)果對比(例)

注a：包括3例假陽性

討 論

近年來，NTM病的發(fā)病率無論在歐美國家還是亞洲國家均逐年上升。根據(jù)2010年全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查資料，NTM分離率2000年為11.1%，2010年上升至22.9%[8]。NTM病診斷困難，高度耐藥，并且復發(fā)率高，對其進行早期診斷是對NTM病進行規(guī)范化治療的前提[9]。以生化試驗為主的分枝桿菌菌種鑒定技術由于操作復雜，耗時而結(jié)果不準確，因此已不常使用[10]。近年來，以免疫層析技術為基礎的MPB64抗原膠體金法，以色譜技術為基礎的氣相及高效液相色譜法，以基因探針、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)及PCR-基因測序方法為代表的分子生物學技術的引入，為NTM病的菌種鑒定提供了更為科學的方法[11]。

NTM和結(jié)核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，致病機制類似。兩者導致機體發(fā)病的臨床癥狀和體征具有較高的相似性[12]，臨床易將NTM肺病誤診為肺結(jié)核[3]。PCR-反向斑點雜交法簡單易行，可同時檢測MTBC和NTM，且PCR-反向斑點雜交法可于1個工作日獲得檢測結(jié)果，分枝桿菌培養(yǎng)需4周獲得培養(yǎng)結(jié)果。PCR-反向斑點雜交法應用于分枝桿菌的鑒定由來已久，現(xiàn)有報道主要應用于大樣本量的結(jié)核分枝桿菌和小樣本量的NTM的研究[13-14]，大樣本量NTM的研究結(jié)果少見。

NTM肺病胸部CT檢查可見支氣管擴張、空洞(尤其是薄壁空洞)影、結(jié)節(jié)影、斑片狀影及小斑片樣實變影、樹芽征、線狀及纖維條索狀影等表現(xiàn)，且通常以多種形態(tài)病變混雜存在[2]。本研究以胸部CT檢查為基礎，選取臨床疑診為NTM肺病的334例患者，分別取痰液行PCR-反向斑點雜交法和培養(yǎng)法檢測并進行比較，探討PCR-反向斑點雜交法對NTM肺病的診斷價值。通過研究發(fā)現(xiàn)2種檢測方法對分枝桿菌的檢出率分別為64.67%和67.66%，差異無統(tǒng)計學意義。在NTM組，PCR-反向斑點雜交法敏感度為82.57%；在結(jié)核病組，PCR反向斑點雜交法特異度為78.57%。筆者認為，以胸部CT檢查為診斷依據(jù)的患者中，應用PCR-反向斑點雜交法行痰液NTM檢測具有較高的敏感度和特異度，且檢測方法簡便、快速，能直接進行菌種鑒定，對指導臨床醫(yī)生快速準確診斷和及時治療有一定的參考意義。

張潔等[13]對1552株涂片抗酸染色陽性的臨床分離株，分別進行PNB-TCH生長試驗和PCR-探針法檢測。結(jié)果顯示：2種檢測方法檢出NTM的符合率為75.4%，MTBC的符合率為99.0%，總體符合率為99.0%。本研究分析兩組患者檢測結(jié)果，PCR-反向斑點雜交法與最終確診結(jié)果相比，總體診斷符合率為83.08%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法與最終確診結(jié)果相比，總體診斷符合率為86.92%。此外，張潔等[13]研究顯示，部分NTM使用PNB-TCH生長試驗進行鑒定時會出現(xiàn)誤差，其中主要涉及堪薩斯分枝桿菌，而PCR-探針法鑒定MTBC和NTM的準確性較高。本研究中PCR-反向斑點雜交法、培養(yǎng)法與最終確診結(jié)果符合率均較高，但與張潔等[13]研究結(jié)果尚有一定差距，本研究檢測方法假陰性率略高。

進一步分析經(jīng)反向斑點雜交法鑒定為NTM的183例患者的NTM菌種：胞內(nèi)分枝桿菌89例，膿腫分枝桿菌39例，鳥分枝桿菌19例，草分枝桿菌11例，龜分枝桿菌10例，堪薩斯分枝桿菌8例，瘰疬分枝桿菌3例，偶發(fā)分枝桿菌2例，次要分枝桿菌2例。與文獻報道的NTM種屬分布的地域特點相符[14]，但與廣州等NTM病高發(fā)地區(qū)的NTM主要菌種分布構(gòu)成比有明顯不同[15]，廣州當?shù)氐腘TM菌種分布構(gòu)成比前3位分別為龜-膿腫分枝桿菌復合群(43.18%)、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復合群(18.24%)、戈登分枝桿菌(8.53%)，其后依次為偶然分枝桿菌(6.96%)、瘰疬分枝桿菌(4.33%)、堪薩斯分枝桿菌(3.67%)、恥垢分枝桿菌(3.15%)和不產(chǎn)色分枝桿菌(2.62%)、蘇爾加分枝桿菌(1.57%)、猿分枝桿菌(1.57%)、瑪爾摩分枝桿菌(1.57%)。本研究中，PCR-反向斑點雜交法在NTM肺病組中假陰性35例，考慮可能的原因為：(1)確診患者中檢測標本包括痰液、灌洗液及病理活檢組織等，而研究方法中的標本僅取患者痰液，標本信息不完全導致假陰性率增高；(2)多種因素可以影響PCR擴增效率，如DNA提取效率、擴增抑制物的存在等，均可導致假陰性；(3)本研究所選患者的痰涂片陽性率低，只有61.68%，不除外患者取痰方法不當導致痰液標本陽性率低；(4)當痰標本中所含菌量較少時，存在檢測假陰性的可能；(5)對NTM與MTBC混合感染的菌株檢測結(jié)果有誤差，于霞等[16]報道，分枝桿菌鑒定試劑盒(分子雜交法)對堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌與H37Rv的混合感染鑒定結(jié)果不佳；孔冬青[17]曾報道，煤工塵肺且存在并發(fā)免疫功能低下的疾病和因素的患者，臨床中痰標本檢測發(fā)現(xiàn)了NTM并發(fā)MTBC；本研究剔除了結(jié)果明確的NTM和MTBC混合感染，但仍不能完全排除未經(jīng)現(xiàn)有檢查結(jié)果證實的混合感染；(6)當靶序列存在個別堿基與探針錯配時仍可以發(fā)生雜交，因此存在個別堿基差異的核苷酸序列不容易區(qū)分[18]，導致產(chǎn)生誤差。

近年來，有研究也報道針對不同靶基因建立多重PCR法進行檢測，鑒定MTBC和NTM，敏感度和特異度更高[19]。筆者認為，應用多重PCR法進行MTBC與NTM的快速檢測是今后的研究方向之一。

由于NTM是一類在環(huán)境中廣泛存在的細菌，單次陽性并不能完全排除污染的可能，此外也必須考慮呼吸道可能存在NTM定植等因素。臨床醫(yī)生判斷時，仍需結(jié)合細菌學依據(jù)、患者臨床表現(xiàn)和胸部影像學資料等多種因素進行綜合考慮。