摘要：應(yīng)用PCR擴增和測序技術(shù)獲得了引進種巖扇貝（Crassadoma gigantea）及我國主要經(jīng)濟扇貝：蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensz‘s）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和海灣扇貝（Argopecten irradians）的12S rDNA全序列，并進行了相關(guān)分析。結(jié)果表明，四種扇貝12S rDNA的序列長度在906～964bp之間，其A+T含量在50.57%～56.77%之間；單倍型數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)分別在2～3、2～3、0.264～0.623、0.00075～0.00207和0.427～1.882之間，均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平；種間遺傳距離在0.079～0.306之間，其中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近，其次是巖扇貝與蝦夷扇貝，而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠(yuǎn)，并且系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝則與其它扇貝聚為另一個單系群，進一步闡明了四種扇貝間的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：12S rDNA；巖扇貝（Crassadoma gigantea）；遺傳變異；親緣關(guān)系 中圖分類號：Q959 文獻標(biāo)志碼：A

巖扇貝（Crassadoma gigantea）隸屬于軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、珍珠貝目（Pterioida）、扇貝科（Pectinidae），原產(chǎn)于北美洲太平洋沿岸海域。因其具有生長速度快、肉質(zhì)鮮美以及抗逆性強等特點，在國外市場備受歡迎。目前國內(nèi)主要養(yǎng)殖的扇貝種類有櫛孔扇貝（Chlamys.farreri）、華貴櫛孔扇貝（Mimachlamys nobilis）、海灣扇貝（Argopectenirradians）和蝦夷扇貝（Patinopecten yessoen-sis）。然而，隨著扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，縱觀整個產(chǎn)業(yè)鏈存在諸多問題，如種質(zhì)衰退嚴(yán)重、疾病災(zāi)害頻發(fā)、品質(zhì)下降等，而新物種的引進將成為解決問題的有效途徑之一。因此，大連海洋大學(xué)曹善茂教授于2012年從加拿大引進巖扇貝種貝并繁育成功。目前，有關(guān)巖扇貝的研究主要集中在生理生態(tài)等方面，其遺傳學(xué)研究在國內(nèi)外卻鮮見報道。作為外來引進新物種，對其遺傳學(xué)及種質(zhì)資源的評估資料仍處短缺狀態(tài)，這將給生產(chǎn)應(yīng)用帶來很大困擾。

線粒體DNA具有母性遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、大小適中、缺乏重組、進化速率相對較快等特點，已廣泛應(yīng)用于種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分子進化等相關(guān)研究，其中rRNA基因同時具有易變區(qū)和保守區(qū)，目前已作為可靠的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于動物的分子進化和系統(tǒng)發(fā)生等相關(guān)研究。因此，擬通過測定巖扇貝、櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝的mtDNA 12S rDNA序列，分析其遺傳變異趨勢，并結(jié)合GenBank其他扇貝的相應(yīng)的基因序列進行系統(tǒng)進化分析，從分子水平上了解巖扇貝的遺傳背景及其系統(tǒng)進化地位，以期為巖扇貝今后的遺傳育種研究工作提供部分基礎(chǔ)信息。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究所使用的巖扇貝為由加拿大溫哥華引進的種貝的F₁代個體，為1齡貝養(yǎng)殖于大連龍王塘海域（代表符號：Y）；蝦夷扇貝（代表符號：X）、櫛孔扇貝（代表符號：Z）均購自于大連新長興海產(chǎn)品市場，為2～3齡貝；海灣扇貝（代表符號：H）取自于山東萊州某養(yǎng)殖場，為1～2齡貝。采樣時間均為2017年5月，每個種隨機取10個樣本，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后取閉殼肌保存于無水乙醇中備用。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取 參考Sambrook等的酚/氯仿抽提法并略做修改。取2μL基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組DNA的完整性，并取1μL在NanoDrop 2000微量分光光度計上測定濃度，最后稀釋成約50ng/μL的工作液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及海灣扇貝的12S rDNA序列擴增根據(jù)GenBank中該物種線粒體基因組全序列設(shè)計特異性引物，使用Primer5軟件進行引物設(shè)計，引物序列具體為：櫛孔扇貝F：5-TTTCTGCTCCGTGGTGTA-3，R：5-ATAGCCCTGCCCATAAGTT-3；蝦夷扇貝F：5-：GTCGGACTTGGTC GTA-CAT-3R：5-ATAGCCCTGCCCA TAAGTT-3；海灣扇貝F：5-AGCCTTCAGCCTA-AATGT-3R：5-TCACCAC CAACCGAAT-AG-3；而巖扇貝的12S rDNA序列則通過其它三種扇貝跨種擴增獲得。

1.2.3測序 PCR反應(yīng)總體系為25μL，包括1μL模板DNA（50ng/μL），2.5μL 10×reactionbuffer，1.0μL dNTP MIX（2.5 mM），1.0μL上下游混合引物（各10μM），0.2μL 1 U Taq DNA聚合酶，18.8μL超純水；PCR反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性5min；94℃變性35s，50℃退火40s，72℃延伸40s，進行38個循環(huán)；最后72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)BioSpin GelExtraction Kit純化回收后，連接到pMDl8-T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選陽性克隆送天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果使用BioEdit7.0進行序列拼接；使用NCBI的BLAST工具搜索其它貝類的同源序列，下載扇貝科7種扇貝以及外源群兩種貽貝的Cytb基因的同源序列（信息見表1）；ClustalX1.83對不同物種的DNA序列進行多重比對，使用GeneMarkS4.6b軟件對巖扇貝的測序結(jié)果進行12S rRNA基因的預(yù)測；使用DNAsp5分析核酸基本參數(shù)，MEGA5.1計算堿基組成和遺傳距離，并基于Neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果

2.112S r DNA序列得堿基組成

利用PCR測序技術(shù)獲得了四種扇貝的12SrDNA全序列，堿基組成結(jié)果如表2所示。首先，四種扇貝12S rDNA序列長度在909～964pb之間，最長的為蝦夷扇貝，其次是櫛孔扇貝，最短的為巖扇貝。四種扇貝的A、T、G、C含量分別在27.709/6～29.59%、23.55%～27.17%、26.40%～28.61%和16.83%～20.81%之間，其A+T含量在50.57%～56.77%之間，最高為巖扇貝，最低為櫛孔扇貝，但均大于G+C含量。

2.212S r DNA序列的遺傳多樣性

基于12S r DNA序列獲得的四種扇貝的遺傳變異參數(shù)如表3。首先，巖扇貝、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和海灣扇貝分別獲得3、2、3、2個單倍型，無共有單倍型，多態(tài)性位點數(shù)依次為2、2、2、3，所有核苷酸變異位點均為轉(zhuǎn)換和顛換變異（多態(tài)性核苷酸位點及各單倍型分情況詳見表4）。四種扇貝的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）在0.264～0.623之間，其中巖夷扇貝最高，其次是蝦夷扇貝，而櫛孔扇貝最低；核苷酸多樣性指數(shù)（7c）在O.00075～0.00207之間，其中海灣扇貝的值最高，其次是巖扇貝，而櫛孔扇貝最低；平均核苷酸差異（k）在0.427～1.882之間，其中最高值為海灣扇貝，其次是巖扇貝，而櫛孔扇貝。所有遺傳變異參數(shù)中，π值和k值之間呈正相關(guān)關(guān)系。

2.3種間遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹

利用獲得的所有12S r DNA序列計算了四種扇貝種間遺傳距離，結(jié)果如表5。四種扇貝的遺傳距離在0.079～0.306之間，其中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近，之后依次為巖扇貝與蝦夷扇貝（0.094）、巖扇貝與櫛孔扇貝（0.105）、櫛孔扇貝與海灣扇貝（0.280）、蝦夷扇貝與海灣扇貝（0.289），而巖扇貝與海灣扇貝之間的遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用獲得的四種扇貝的所有12S r DNA單倍型序列，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中其他扇貝的相應(yīng)序列，基于鄰接法Neighbor-Joining（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選取蚶科的兩個種作為外源群，結(jié)果如圖1。除外源群物種獨自聚為一個分支以外，扇貝科的所有物種分為兩個單系群，其中一個單系群包括蝦夷扇貝的3個單倍型、櫛孔扇貝的2個單倍型、巖扇貝的3個單倍型以及Mimachlamys、Pecten兩個屬的物種，每個屬的物種又獨自聚為一個小分支，具體為蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支，再與巖扇貝聚類，之后與Mimachlamys聚類，最后與Pecten聚為一個單系群；而Argopecten的四個種則獨自聚為另一個單系群，其中海灣扇貝與其亞種墨西哥海灣扇貝聚為一個小分支，而另兩個種聚為一個小分支。

3討論

3.112S r DNA的序列特征及遺傳多樣性

DNA序列分析是鑒定生物親緣種，研究系統(tǒng)進化關(guān)系的方法之一。12S rRNA屬線粒體基因，在動物進化機制和系統(tǒng)發(fā)育研究上是一種有效的分子標(biāo)記。本研究獲得的四種扇貝的12Sr DNA全序列經(jīng)Clustal比對發(fā)現(xiàn)，四種扇貝的12S r DNA序列同源性較低，種間變異較大。但四種扇貝的序列長度并無明顯的種間長度多態(tài)，這在其它動物的研究中也存在類似的現(xiàn)象。另外，四種扇貝的12S r DNA序列的A+T含量均大于G+C含量，符合動物線粒體基因的堿基組成特征，并與其它貝類的研究結(jié)果相一致。

遺傳多樣性是物種延續(xù)和發(fā)展的基礎(chǔ)，其豐富的種群在復(fù)雜多變的自然環(huán)境中表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性。而通常來說，核苷酸多樣性指數(shù)（π）和單倍型多樣性指數(shù)（Hd）是評估種群遺傳多樣性的兩個重要指標(biāo)，但由于單個堿基的變異就能生成一種新的單倍型，Hd值可在短時間內(nèi)積累變異而快速提高，而丌值的提高需要長時間的積累，因此兀值在衡量種群遺傳多樣性時比Hd值更具代表性。本研究中，四種扇貝的π值在0.00045～0.00207之間。但Lan等認(rèn)為，當(dāng)π值低于0.0047時，則表明遺傳多樣性處于較低水平，說明本研究中采樣區(qū)的四種扇貝均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。其原因可能與實驗樣本均為養(yǎng)殖群體有關(guān)。

3.2遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

物種間的遺傳距離是衡量其親緣關(guān)系的重要指標(biāo)。本研究中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近，表明其親緣關(guān)系最近，此部分結(jié)果與秦艷杰等應(yīng)用AFLP技術(shù)的研究結(jié)果一致，而巖扇貝與海灣扇貝之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其次，巖扇貝與其它三種扇貝之間則表現(xiàn)為巖扇貝與蝦夷扇貝的親緣關(guān)系最近，而與海灣扇貝之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

目前，在扇貝系統(tǒng)進化方面已有大量的研究報道，如Insua等和Jose Lopez-Pinon等分別利用ITSI和5S rDNA序列對歐洲的四種扇貝進行了親緣關(guān)系探討；胡麗萍等和Canapa等利用16S rDNA部分序列進行了相關(guān)研究；而Barucca等和Puslednik等則同時利用16S rDNA和12S rDNA序列構(gòu)建了扇貝的系統(tǒng)進化樹。其中，Puslednik等的研究對象較為豐富，包括本研究中的蝦夷扇貝、海灣扇貝以及引進種巖扇貝在內(nèi)，但該研究獲得的僅為相應(yīng)基因的部分序列，而非基因全序列。盡管缺失了櫛孔扇貝，但其結(jié)果顯示蝦夷扇貝與Chlamys的冰島扇貝獨自聚為一個分支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝則與其它扇貝聚在另外一個大分支。本研究中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝聚為一個分支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝聚為另一個單系群。兩者的研究表現(xiàn)出極大的相似性。

4結(jié)論

綜上所述，本研究利用PCR擴增及測序技術(shù)，獲得了巖扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝和櫛孔扇貝的mtDNA 12S r DNA全序列，并進行了遺傳變異水平及系統(tǒng)進化分析。結(jié)果表明：采樣區(qū)四種扇貝均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平，并且四種扇貝之間，蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近，其次是巖扇貝與蝦夷扇貝，而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠(yuǎn)，闡明了四種扇貝之間的親緣關(guān)系。該研究結(jié)果將為巖扇貝的引種與推廣養(yǎng)殖以及今后的遺傳育種研究工作提供參考信息。

（收稿日期：2017-12-27）