商瑋 徐子涵 郭郡浩 董曉蕾 趙智明 蔡輝

解放軍南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎和骨破壞為特征的自身免疫性疾病[1]。關(guān)節(jié)周圍骨侵蝕主要發(fā)生于滑膜與軟骨交界處，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙狹窄，從而發(fā)生不同程度的關(guān)節(jié)僵硬、畸形，造成RA患者功能障礙和殘疾。破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)在這一病理過程中起關(guān)鍵作用，研究表明RA患者OC活性增加可加重全身性骨丟失[2]。活化T細(xì)胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，NFATc1)是促進(jìn)OC分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)通過核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)/AP-1/c-fos和鈣離子信號通路兩條信號通路調(diào)節(jié)NFATc1的活化，促進(jìn)OC分化[3]。

姜黃素(curcumin，Cur)是從中藥姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[4]，已有研究發(fā)現(xiàn)Cur能改善RA患者疾病活動度[5]。本課題前期發(fā)現(xiàn)Cur能調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，提高佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠骨密度水平[6]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過應(yīng)用Cur干預(yù)RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，檢測其對OC生成及NF-κB p65、NFATc1蛋白表達(dá)的影響，探討Cur影響RA患者OC生成的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

血液標(biāo)本來源：確診活動期RA患者12例，年齡(56.3±15.1)歲，RA診斷均符合2010年RA的ACR/EULAR分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 材料

NF-κB p65、NFATc1多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，RANKL、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)(Pepro Tech公司，美國)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季青生物工程材料有限公司，中國)，人淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司，美國)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司，中國)，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：FY13561019，南通飛宇生物科技有限公司，中國)。

1.3 方法

1.3.1RA-OC原代培養(yǎng)及鑒定：采用密度梯度離心法分離RA患者PBMC，以2×106個/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中[8]，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～3 h，吸除皿內(nèi)培養(yǎng)液以去除懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞用胰酶消化，將細(xì)胞調(diào)節(jié)成2×105個/cm2接種于24孔板中，用含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF及20% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d換液一次。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色及骨吸收試驗(yàn)對RA-OC進(jìn)行鑒定。

1.3.2Cur細(xì)胞毒性檢測：取96孔板，各孔加入100 μL的PBMC細(xì)胞懸液(5×105/mL)，37 ℃孵育過夜，加入含Cur培養(yǎng)基，濃度為0、2.5、5和10 μmol/L，每組3個復(fù)孔，分別孵育24、48 和72 h，加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，于450 nm 波長處測吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3TRAP染色檢測Cur對RA-OC分化的影響：RA患者PBMC在含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF、20% FBS及不同濃度Cur(0、2.5、5和10 μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d換液。14 d后，參照TRAP染色試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色，光鏡下觀察染色結(jié)果，并隨機(jī)選取10個視野，計(jì)數(shù)TRAP陽性細(xì)胞(細(xì)胞核≥3個，胞質(zhì)呈酒紅色)，結(jié)果用“個/10個視野”表示，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.3.4NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測：Western-blotting檢測：細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白和胞漿蛋白，進(jìn)行蛋白定量，100 ℃變性3～5 min，上樣后進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，NF-κB p65一抗(1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜(胞漿蛋白以β-Actin為內(nèi)參，核蛋白以Lamin B1為內(nèi)參)，二抗(1∶2000稀釋)室溫振蕩孵育2 h，滴加ECL試劑于X線下曝光顯影，計(jì)算各條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比來表示。免疫熒光染色檢測：將分離獲得的PBMC接種于24孔板內(nèi)無菌蓋玻片上，設(shè)陰性對照組(M-CSF+/RANKL-)、陽性對照組(M-CSF+/RANKL+)、Cur 5 μmol/L組(M-CSF+/RANKL+/Cur 5 μmol/L)，按分組加入含有細(xì)胞因子和干預(yù)藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后4%多聚甲醛固定，0.5% Triton透化15 min，1% BSA室溫封閉30 min， 5% BSA稀釋的NF-κB p65多克隆一抗(1∶50)，4 ℃孵育過夜，5% BSA稀釋的TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，5 μg/mL DAPI避光孵育5 min，封片固定，于熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

1.3.5NFATc1蛋白表達(dá)的檢測：Western-blotting檢測：細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量， 100 ℃變性3～5 min，上樣后進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，NFATc1一抗4 ℃孵育過夜，以β-Actin為內(nèi)參，二抗室溫振蕩孵育2 h，滴加ECL試劑于X線下曝光顯影，計(jì)算各條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比來表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RA-OC的原代培養(yǎng)及鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)至第14天，胞體明顯增大，可見多個多核細(xì)胞，折光性強(qiáng)，形態(tài)呈類圓形和不規(guī)則形，可見片狀偽足和絲狀突起，胞內(nèi)有3～5以上的細(xì)胞核，胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡，符合OC形態(tài)特征。(圖1 A)

TRAP染色：200×光鏡下可見形態(tài)不規(guī)則、體積較大的多核細(xì)胞。胞漿見散在的紫紅色顆粒樣沉淀，顏色較深。蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞核3～5個以上不等，符合TRAP染色陽性特征。(圖1B)

骨吸收陷窩檢測：取與細(xì)胞共培養(yǎng)21 d的骨磨片，在光鏡下觀察可見骨表面有大小不等，深淺不一，不規(guī)則橢圓形的骨吸收陷窩，邊緣清晰。甲苯胺藍(lán)染色后，骨吸收陷窩呈藍(lán)紫色異染(圖1C)。掃描電鏡下觀察，可見陷窩底部具有因骨膠原纖維殘留而顯粗糙的骨吸收特征。(圖1D)

圖1 RA-OC的鑒定A. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(200×)B. TRAP染色(200×)C. 倒置顯微鏡下骨吸收陷窩(200×)D. 掃描電鏡下骨吸收陷窩(1000×)Fig.1 Identification of osteoclasts from RA patientsA. Observation of cell morphology (200×). B. TRAP staining (200×). C. Bone resorption lacunae observed by inverted microscope (200×). D. Bone resorption lacunae observed by scanning electron microscope (1000×).

2.2 Cur對細(xì)胞存活率的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、48 和72 h，各濃度組與對照組相比，對PBMC細(xì)胞存活率無明顯影響(P>0.05)(圖2)，說明Cur 2.5、5和10 μmol/L的濃度對PBMC未產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

圖2 Cur對細(xì)胞存活率的影響Fig.2 The effect of curcumin on cell viability

2.3 Cur對RA-OC分化的影響

200×光鏡下見，Control組為正常OC，細(xì)胞形態(tài)均一、分布均勻、輪廓清晰，有3～5個以上細(xì)胞核(圖3 A)。經(jīng)不同濃度Cur干預(yù)后，視野內(nèi)OC數(shù)量明顯減少，形態(tài)各異，大部分為未分化成熟的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(osteoclast precursor，OCP)(圖3 B、3C、3D)。TRAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與Control組比較，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組TRAP+細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05),說明Cur對RA-OC分化具有抑制作用。(圖4)

圖3 TRAP染色(200×)A. Control組；B. Cur 2.5 μmol/L 組；C. Cur 5 μmol/L 組；D. Cur 10 μmol/L 組Fig.3 TRAP staining(200×)A. Control Group；B. Cur 2.5 μmol/L Group；C. Cur 5 μmol/L Group；D. Cur 10 μmol/L Group

2.4 Cur對RA-OC NF-κB p65表達(dá)的影響

分別提取各組細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，通過Western-blotting檢測NF-κB p65在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的表達(dá)，觀察NF-κB p65入核表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組細(xì)胞漿中NF-κB p65的蛋白表達(dá)明顯升高，而細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，提示Cur具有抑制NF-κB p65入核表達(dá)的作用，并且隨著干預(yù)濃度的增加，抑制NF-κB p65入核表達(dá)的作用更加明顯。(圖5)

圖5 Cur對RA-OC細(xì)胞漿和細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)的影響注：* P<0.05Fig.5 The effect of curcumin on the expression of NF-κB p65 in cytoplasm and nucleus of osteoclasts of RA patientsNote: * P<0.05

圖4 Cur對RA-OC分化的影響注：* P<0.05Fig.4 The effect of curcumin on osteoclast differentiation in RA patientsNote:* P<0.05

通過細(xì)胞免疫熒光染色法觀察Cur對RA-OC NF-κB p65核易位的影響。由圖6我們觀察到，陰性對照組NF-κB p65主要分布于細(xì)胞漿中；RANKL干預(yù)后，NF-κB p65在細(xì)胞漿的表達(dá)減少，在細(xì)胞核的表達(dá)增加；5 μmol/L Cur干預(yù)后，與陽性對照組相比，NF-κB p65在細(xì)胞漿的表達(dá)增加，在細(xì)胞核的表達(dá)減少, 提示Cur具有抑制RA-OC NF-κB p65核易位的作用。

2.5 Cur對RA-OC NFATc1表達(dá)的影響

Western-blotting檢測NFATc1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Cur 2.5 μmol/L組、Cur 5 μmol/L組和Cur 10 μmol/L組細(xì)胞中NFATc1蛋白表達(dá)水平均低于Control組(P<0.05)，提示Cur顯著抑制RA-OC NFATc1蛋白的表達(dá)。(圖7)

3 討論

圖6 免疫熒光檢測NF-κB p65在RA-OC中的表達(dá)Fig.6 Detection of NF-κB p65 expression in osteoclasts of RA patients by immunofluorescence staining

圖7 Cur對RA-OC NFATc1表達(dá)的影響注：* P<0.05Fig.7 The effect of curcumin on the expression of NFATc1 in osteoclasts of RA patientsNote:* P<0.05

滑膜炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞是RA病理變化的中心環(huán)節(jié)，是患者發(fā)生關(guān)節(jié)變形和殘疾的主要原因。RA關(guān)節(jié)局部的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synovial cells，F(xiàn)LS)釋放大量的炎癥介質(zhì)，形成局部炎癥環(huán)境[3]，分泌RANKL與OCP表面上的 RANK 結(jié)合后，通過NF-κB/AP-1/c-fos和鈣離子信號兩條信號通路，調(diào)節(jié)NFATc1的活化，促進(jìn)OC分化[9]。NFATc1是OC分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，NFATc1被激活后可轉(zhuǎn)錄出OC特異性基因如TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶-9[10]。

Cur是從姜黃中獲得的四萜類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[4]。在本課題組前期研究工作[6,11,12]基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索Cur在治療RA骨破壞中的作用及其可能機(jī)制，通過體外誘導(dǎo)RA患者PBMC分化為OC，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色、骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)對OC進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)中使用的外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)法能成功獲得分化成熟且具有骨吸收功能的OC。選用對細(xì)胞存活率無明顯影響的濃度2.5、5和10 μmol/L作為本實(shí)驗(yàn)Cur干預(yù)濃度，在實(shí)驗(yàn)中觀察到Cur具有抑制RA-OC分化的作用。

OC的分化涉及數(shù)條通路，其中NF-κB/NFATc1信號通路是OC分化中的重要信號途徑之一[13]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞因子、病原體和輻射等刺激的影響下被快速的激活。p65是NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的核心亞基，轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核后，驅(qū)動靶基因的表達(dá)而發(fā)揮功能[14]。本實(shí)驗(yàn)分別提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，檢測NF-κB p65在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的表達(dá)，結(jié)果提示Cur具有抑制NF-κB p65入核表達(dá)的作用。免疫熒光結(jié)果與Western-blotting結(jié)果與相一致，分別從NF-κB p65的定量及定位表達(dá)說明Cur具有抑制RA-OC NF-κB p65核易位的作用。Bharti等[15]研究發(fā)現(xiàn)Cur能抑制RAW264.7 OC形成，與抑制NF-κB的活化有關(guān)，本研究的結(jié)果與其研究結(jié)果相符合。

NFATc1是重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與OC特異性基因的調(diào)控表達(dá)，對OC分化、融合、粘附及骨吸收功能至關(guān)重要[16]。本研究通過Western-blotting檢測各組NFATc1蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示Cur抑制NFATc1在RA-OC中的表達(dá)。OCP的RANK活化后，激活多條途徑誘導(dǎo)NFATc1的活化，而NFATc1是NF-κB信號的靶基因。因而，Cur導(dǎo)致的NFATc1表達(dá)的抑制，可能與其對NF-κB活化的抑制有關(guān)，同時，NFATc1表達(dá)的抑制，影響了RA-OC的分化與成熟。

綜上，Cur能抑制RA-OC分化過程中的NF-κB信號，抑制NF-κB p65的入核表達(dá)，降低轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的表達(dá)，從而抑制RA-OC的分化。本研究進(jìn)一步闡明Cur改善RA骨破壞的作用機(jī)制，為開發(fā)Cur相關(guān)藥物應(yīng)用于RA治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。