唐沖 劉正 吳四軍 王其飛 鄭繁榮 張光武*

1. 北京大學首鋼醫(yī)院骨科， 北京 100144 2. 浙江臺州市中心醫(yī)院骨科， 浙江 臺州 318000

骨質疏松癥是一種以骨量減少為特征的全身骨代謝性疾病，導致骨組織微結構退化，增加骨脆性和骨折易感性。隨著社會老齡化，骨質疏松癥的發(fā)病率逐年升高，導致患者出現(xiàn)慢性骨質疏松性疼痛，并可因低能量損傷出現(xiàn)骨質疏松性骨折，增加病人致殘率及死亡率，增加社會醫(yī)療成本，已成為全球關注的公共健康問題[1-3]。近些年來，全基因組相關研究已證實，至少有60多個基因位點與骨質疏松癥相關[4,5]，其中PTCH1基因的rs28 377 268位點突變可導致脊柱骨密度降低、增加骨質疏松性骨折風險[6]。而關于該基因位點與骨代謝標志物濃度之間的關系尚無相關報道。本文將探究PTCH1基因的rs28 377 268位點等位基因頻率和基因型頻率在老年骨質疏松人群中的分布特點，并探討該基因位點多態(tài)性與骨代謝標志物的相關性，有助于我們從基因水平、骨代謝狀況闡明老年性骨質疏松性骨折的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

對象資料：選取2016年1月至2016年6月北京大學首鋼醫(yī)院骨科脊柱組收治的160例患者，其中骨質疏松性椎體壓縮骨折患者(骨折組)和脊柱退行性病變(包括頸椎病、腰椎間盤突出、腰椎管狹窄腰椎滑脫等)骨質疏松患者(對照組)各80例。骨折組中男性28例，女性52例，平均年齡(75.2±8.9)歲。對照組中男性37例，女性43例，平均年齡(73.7±8.5)歲。測量并計算每位患者的骨密度(bone mineral density，BMD)及體重指數(shù)(body mass index，BMI),骨折組和對照組在性別、年齡、BMD及BMI上均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表1)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

納入標準：(1)年齡：男性≥60歲，女性≥55歲；(2)骨密度：T值≤-2.5；(3)骨折組均為低能量損傷，病史、查體及影像學檢查證實為椎體壓縮骨折；(4)患者意識清晰，理解本研究目的及要求，同意并簽署書面知情同意書。

排除標準：(1)年齡：男性<60歲，女性<55歲；(2)骨密度：T值>-2.5；(3)高能量損傷導致的椎體骨折；(4)患者不能或拒絕簽署書面知情同意書；(5)長期服用影響骨代謝藥物史，如類固醇類激素等；(6)患有影響骨代謝的疾病，如糖尿病、甲狀旁腺功能亢進、惡性腫瘤、類風濕等；(7)有嚴重肝、腎、胃腸等重要臟器疾?。?8)存在影響B(tài)MD測量的因素，如脊柱手術史。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度測定[7]：采用雙能X線骨密度測定儀測量腰椎L1～L4椎體骨密度。

1.2.2骨轉換標志物測定：采空腹靜脈血2 mL，用羅氏全自動化學發(fā)光免疫分析儀及試劑盒檢測骨鈣素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(beta-crosslaps of type I collagen cross-linked C-telopeptide,β-CTX)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(procollagen I N-terminal propeptide,P1NP)、25-羥維生素D(25-hydroxyvitamin D,25(OH)D)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)濃度。

1.2.3SNP分型：清晨空腹時采集肘靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，置于-80 ℃冰箱保存。采用酚/氯仿法提取外周血白細胞DNA, -20 ℃保存。上海生物工程技術有限公司合成PTCH1基因rs28 377 268位點引物：上游引物：5′-GGGTAAATTTGGATCCGATTGAG-3′，下游引物：5′-TGGTTTTGATTACTGAGGCCAAG-3′。采用SNaPshot技術基因分型。核心反應(即延伸反應)體系中包含：測序酶、四種熒光標記ddNTP、緊挨多態(tài)位點5′-端的不同長度延伸引物、包含SNP位點的PCR產物模板。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

如表1所示，本研究中160例研究對象的SNP檢出率為100%，其中骨折組及對照組G、T等位基因頻率均為128(80%)、32(20%)，GG、GT、TT基因型頻率分別為53(66.25%)、22(27.50%)、5(6.25%)和50(62.50%)、28(35.00%)、2(2.5%)，兩組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。骨折組和對照組的等位基因頻率及基因型頻率分布均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

在骨轉換標志物方面，骨折組中血清OC、PINP、β-CTX 及25(OH)D濃度較對照組均無統(tǒng)計學意義，而PTH濃度明顯高于對照組(P<0.05)(見表1)。另外，血清OC、PINP、β-CTX 及25(OH)D 濃度在GG、GT、TT3種基因型之間亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而總體及骨折組血清PTH濃度在GT、TT基因型中均高于GG基因型，其中TT基因型顯著高于GG、GT基因型(P<0.05)。

表1 兩組患者的基本信息、PTCH1基因及骨代謝標志物比較Table 1 Comparison of basic information, PTCH1 gene and bone metabolic markers between the two groups

3 討論

原發(fā)性骨質疏松癥是絕經后女性及老年男性最常見的全身性骨代謝疾病，以骨量丟失、骨微結構破壞、骨骼脆性增加和骨折風險上升為特點[8]。骨質疏松性椎體壓縮骨折(osteoporotic vertebral compression fractures，OVCFs)是由于老年人罹患骨質疏松癥后，骨密度及骨強度明顯降低，受到輕微暴力甚至在日?；顒又邪l(fā)生的胸腰椎骨折，是骨質疏松癥最嚴重的并發(fā)癥，其中70歲以上人群OVCFs的發(fā)生率高達20%，且隨年齡增加而增加[2,3,9,10]。臨床上，除了用骨密度檢測作為診斷骨質疏松癥的金標準外，常使用骨代謝標志物反映骨代謝的病理生理變化，包括骨代謝調控激素和骨轉換標志物，其中骨代謝調控激素包括維生素D和PTH，而PINP和β-CTX則是骨形成和骨吸收的首選骨轉換標志物，被國際骨質疏松基金會推薦為骨質疏松療效檢測的重要指標[11]。

表2 血清骨代謝標志物在三種基因型之間的比較Table 2 Comparison of serum bone metabolic markers between the three

Hedgehog(Hh)信號通道是調控個體發(fā)育過程的重要通路,其在軟骨內骨化過程中通過Indian Hedgedog(IHH)調控成骨細胞分化，對成骨細胞的形成起著不可或缺的作用[12,13]。IHH結合功能性跨膜蛋白受體Ptched1(PTCH1)后通過跨膜蛋白Smoothened(SMO)激活信號通道，抑制蛋白水解切割的GLI3阻遏物(GLI3R)的產生并促進全長GLI2激活物(GLI2A)的產生，促進RUNX2+OSX+細胞形成，從而刺激成骨細胞分化，故PTCH1等位基因出現(xiàn)突變時將會影響成骨過程[14-16]。Styrkarsdottir等[6]證實rs28 377 268位點位于PTCH1基因的15號內含子，其次要等位基因可導致脊柱骨密度降低、增加骨質疏松性骨折風險(OR=1.09)。然而目前尚無中國人該位點的基因及基因型頻率報告，以及其多態(tài)性與老年人骨代謝標志物關系的相關性研究。

本研究中，骨折組和對照組PTCH1基因rs28 377 268位點的G、T等位基因頻率均為80%、20%，GG、GT、TT基因型頻率分別為66.25%、27.50%、6.25%和62.50%、35.00%、2.5%，兩組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，提示本研究對象的人群遺傳穩(wěn)定、研究數(shù)據可靠。兩組間的基因頻率及基因型頻率均無統(tǒng)計學意義，兩組中等位基因T的頻率相對于Styrkarsdottir等的報道(11.4%～22.6%)無明顯差異，而GT基因型頻率明顯高于16.71%[6]，提示該位點等位基因頻率在不同區(qū)域和種族無明顯差異，而基因型頻率分布存在區(qū)域差異和種族差異。

在本研究中骨折組血清中的OC、PINP、β-CTX及25(OH)D濃度相對于對照組均無統(tǒng)計學意義，而PTH濃度明顯高于對照組(P<0.05)，提示骨質疏松性椎體壓縮骨折患者的甲狀旁腺激素濃度較高，作用于破骨細胞，使骨吸收作用大于骨形成作用，導致骨量丟失，在低能量損傷時易發(fā)生脆性骨折。另外四項骨代謝標志物可能由于半衰期相對較長、代謝途徑不同，在兩組間未能體現(xiàn)出差異，如果增加病例數(shù)或延遲血生化檢測時間可能會出現(xiàn)結果差異。兩組患者中骨密度無明顯差異可能與樣本量較小相關。在三種基因型比較方面，因對照組中TT基因型例數(shù)僅2例，未進行單因素方差分析，故我們發(fā)現(xiàn)GG、GT、TT三種基因型在OC、PINP、β-CTX及25(OH)D四項骨代謝標志物上亦無明顯統(tǒng)計學差異，而TT基因型的血清PTH濃度明顯高于GG、GT基因型(P<0.05)，且GT基因型的PTH濃度亦略高于GG基因型，提示等位基因T在血清PTH濃度方面起一定作用，可能T等位基因表達抑制了IHH與PTCH1的結合，IHH濃度升高，而IHH可刺激甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)的表達，PTHrP與PTH具有相同受體，PTHrP競爭PTH受體，致使血清中PTH增加[17,18]。此外，PTHrP、PTH共同作用于破骨細胞，促進骨吸收，導致骨質疏松，增加骨質疏松脆性骨折風險。

4 結論

綜上所述，PTCH1基因rs28 377 268位點在骨質疏松患者中G、T等位基因的表達頻率分別為80%、20%，基因頻率及基因型頻率在脊柱骨折組和對照組間無明顯差異。脊柱骨折患者的血清PTH濃度明顯高于對照組，且GT、TT基因型的血清PTH濃度均高于GG基因型，其中TT基因型顯著高于GG、GT基因型(P<0.05)，提示rs28377268-T等位基因高表達可能間接升高血清PTH濃度，促進骨質疏松發(fā)生，增加椎體脆性骨折風險。