李寧 謝興文 宋敏 李建國 白壁輝 柴利軍 周文杰*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

道路交通傷及我國老齡化社會的到來，致使骨折的發(fā)生率大幅度提高[1-3]。如何提高骨折后骨缺損的治愈率及愈合時間是骨科研究的熱點與難點。已有研究表明，麝香不僅能夠阻斷IL-1β對體外終板軟骨細胞的破壞[4]，而且能夠增加骨密度，對骨壞死有治療作用[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香可促進顱骨骨缺損模型大鼠骨組織中基質(zhì)細胞衍生因子1、單核細胞趨化蛋白 1和肝細胞生長因子的表達。本項研究采用蛋白印跡技術(shù)擬檢測高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)的表達，以期探討麝香促進骨缺損愈合的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：健康6周齡SPF級SD大鼠300只，雌雄各半，體重(200±20)g，均購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由進食水。動物設(shè)施使用證明No：00000230，動物合格證號：62001000000201。

1.1.2藥物和試劑：麝香(蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，批號:20151001)。氯胺酮注射液(西安力邦制藥有限公司，國藥準字H20054749)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：20151231)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：20160118)，北京索萊寶有限公司；抗HMGB1兔多克隆抗體、抗BMP2兔多克隆抗體，生工生物工程股份有限公司；GAPDH(批號：ZS-257780)、山羊抗兔IgG/辣根酶標記(批號：122107)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯色試劑(批號：1515601)，美國 Millipore公司。

1.1.3設(shè)備：90顱骨鉆(STRONG公司)；DNM-9602酶標分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司； PowerPoc Basic凝膠電泳儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析儀，美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1顱骨骨缺損模型的制備：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按照0.1 g/kg的劑量腹腔注射氯胺酮，麻醉顯效后，俯臥位固定大鼠頭部及四肢，頭部術(shù)區(qū)褪毛、碘伏消毒，取1～1.5 cm的縱行切口，分離骨膜、暴露顱骨，利用顱骨鉆在頂骨造成直徑約6 mm的圓形骨缺損，鹽水沖洗，去除殘存骨屑，逐層縫合后用碘伏消毒傷口。

1.2.2分組與給藥：造模完成后將大鼠按體重采用隨機數(shù)字表法分為對照組和給藥組，每組150只，再將這兩個組按照第7、14 和28 天分為3個小組，每組50只。給藥組按42 mg/kg灌服麝香，對照組灌服等體積的生理鹽水，均每日灌胃1次。

1.2.3標本采集與指標檢測：分別在第7、14 和28 天時進行顱骨骨缺損處取材。組織蛋白的提取嚴格按照BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明操作，蛋白上樣總量每個泳道為40 μg。SDS-PAGE凝膠制備嚴格按照試劑盒說明操作，120 V電泳至溴酚藍移到凝膠底部，冰水浴200 mA轉(zhuǎn)膜60 min，5 %脫脂奶粉封閉90 min，分別加入BMP2一抗(稀釋度為1∶500)、HMGB1一抗(稀釋度為1∶2000)和GAPDH一抗(稀釋度為1∶2000)，冰箱4 ℃過夜。第二天TBST洗膜3次，每次10 min，山羊抗兔辣根酶標記的二抗室溫孵育90 min(稀釋度為1∶4000)，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯影后凝膠成像分析儀采集圖像信號，Image J軟件分析各組條帶，將各組灰度值與內(nèi)參比較即得HMGB1和BMP2的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

給藥組HMGB1、BMP2在第7 天的表達均達到峰值(P<0.05)，第14 天時降低，第28 天時表達最低；與對照組比較，第7 天 HMGB1、BMP2表達均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組第7 和14 天 HMGB1的表達明顯高于本組第28 天(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 HMGB1和BMP2在顱骨骨缺損模型大鼠組織中表達的結(jié)果Fig.1 Expression of HMGB1 and BMP2 in rat models of calvarial defect注：A、B、C為對照組，D、E、F為給藥組

3 討論

在臨床上由創(chuàng)傷、感染、畸形矯正等因素造成的骨缺損最為常見。目前，治療骨缺損的方法包括骨移植、Masquelet技術(shù)、基因治療等，但這些方法都有不同的缺點和局限性[6-8]。近些年，研究較多的組織工程技術(shù)為骨缺損的治療提供了新思路，而種子細胞、激活因子和支架材料等是其研究的主要方面[9]。

HMGB1是存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及細胞運動密切相關(guān)，因其在聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)中遷移速度快而得名[10]。近年來，HMGB1在炎癥過程中作為晚期炎性因子出現(xiàn)而備受關(guān)注，由損傷和壞死的細胞釋放，此外，內(nèi)毒素及多種炎性因子均可誘導HMGB1的釋放從而介導炎性反應(yīng)[11,12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)尼古丁能抑制由內(nèi)毒素或TNF-α誘導HMGB1的釋放，并提高膿毒癥實驗?zāi)Ｐ偷纳媛?。BMPs是一類能促進骨形成和再生的誘導劑，屬于TGF-β超家族,其中BMP2是研究的熱點，它可誘導間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，在骨折愈合的早期發(fā)揮了重要的成骨作用[14-16]。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)低功率激光照射能誘導BMP2促使小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化。董萬濤等[18]對脛骨骨缺損兔模型的研究發(fā)現(xiàn)，消定膏促進骨缺損愈合的機制與TGF-β/BMPs信號通路有關(guān)。

表1 顱骨骨缺損模型大鼠骨組織中HMGB1和BMP2的表達水平Table 1 Expression levels of HMGB1 and BMP2 in bone tissue of rats with cranial bone defect

注：與對照組比較,*P<0.05；與本組第28天比較,#P<0.05

麝香具有開竅醒神、活血通經(jīng)、消腫止痛之功效[19]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，麝香主要含大環(huán)化合物、甾體化合物、多肽蛋白質(zhì)類化合物等，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)等有廣泛的生理活性[20,21]。本次研究發(fā)現(xiàn)，麝香可促進HMGB1、BMP2在骨缺損處骨組織中的表達，在第7 d時HMGB1和BMP2的表達最高，隨后依次降低，說明麝香在骨缺損的愈合過程中發(fā)揮了作用，促使相關(guān)的因子向骨缺損處的遷移，那么，麝香是否能夠促進更多的細胞因子的表達以及通過哪些途徑遷移至骨缺損處有待進一步的研究。